WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS


Pages:     | 1 |   ...   | 32 | 33 || 35 |

«БОРЬБА С ЛЕЙШМАНИОЗОМ Доклад на заседании Комитета экспертов ВОЗ по борьбе с лейшманиозом, Женева, 22–26 марта 2010 года Всемирная организация здравоохранения Всемирная ...»

-- [ Страница 34 ] --

• Отсеките какую-нибудь часть оставшегося меха стерильными • Промойте оставшуюся ткань, несколько раз меняя солевой раствор или сбалансированный солевой раствор с пролином, содержащий пенициллин (100 000 м.е./мл).

• Разрежьте ткань на очень тонкие слои или измельчите в • Инокулируйте культуральную среду и животных и приготовьте Выделение из диких переносчиков Метод, применяемый для выделения паразитов из насекомых, зависит от возможности их транспортировки в лабораторию живыми. Прямая инокуляция кишечников москитов в культуральную среду сопряжена с высокой вероятностью грибкового заражения любой получаемой культуры, и эта процедура особенно рискованна в полевых условиях.

Выделение в лабораторных условиях • Тщательно промойте москитов в стерильном солевом растворе или в сбалансированном солевом растворе с пролином.

• Поместите каждое насекомое в капле стерильного раствора на стерильное предметное стекло микроскопа, рассеките кишечник и исследуйте его под микроскопом.

• Если обнаруживается кишечник, содержащий промастиготы, выдавите его содержимое в солевой раствор, используемый для рассечения, и инъецируйте прямо в культуральную среду, или поместите в среду весь кишечник. Более надежный метод – это инокуляция экспериментального животного, например хомяка, содержимым кишечника инфицированного москита и повторное выделение Leishmania из хомяка.

Выделение в полевых условиях In vitro выделение в полевых условиях чрезвычайно затруднительно изза возможности бактериального и грибкового заражения культур. Успешное выделение в культуру возможно, но для этого необходим большой опыт. В полевых условиях значительно успешнее происходит in vivo выделение. Инокулируйте инфицированные кишечники прямо в мордочки, лапки и перитонеальные полости хомяков, затем продолжайте процедуру в соответствии с описанием, приведенным выше.

In vivo выделение In vivo выделение предполагает инокуляцию материала, содержащего Leishmania, в восприимчивых лабораторных животных. Наиболее подходящим животным является золотистый хомячок. Иногда используются другие животные, например различные линии инбредных (в частности, BALB/c) и аутбредных мышей, но они не так однородно восприимчивы к видам Leishmnaia, как хомяки.

Хомяков инокулируют или интрадермально в нос или дорсальные поверхности задних лап – для дерматропных Leishmania, или интраперитонеально для висцеральных организмов. Затем Leishmania выделяют из хомяков в культуру одним из следующих способов:

• Подождите до тех пор, пока поражение не станет явным (кожный лейшманиоз) в месте инокуляции, затем получите культуру из • Отметьте точное место инокуляции хомяка; подождите 7–14 дней, затем умертвите животное. Нужно иссечь ткань, в которую была сделана инокуляция, и получить из нее культуру обычным способом. У этого метода есть значительное преимущество: не нужно ждать, когда поражение станет явным; эта задержка может быть очень продолжительной – до 1 года, как, например, при инфицировании некоторыми штаммами L. braziliensis.

• Умертвите животное и сделайте окрашенные мазки из материала печени и селезенки. В случае положительного результата удалите в асептических условиях части инфицированной ткани и произведите посев в культуральную среду.

Содержание организмов в лаборатории Правильный выбор культуральной среды особенно важен при попытках получить культуру Leishmania. К сожалению, трудно прогнозировать, для роста какого из видов окажется благоприятной та или иная культуральная среда. Если возникают сомнения, выберите одну или большее число содержащих кровь агаровых сред, которые описаны ниже; эти среды активно применяются для выделения Leishmania Старого и Нового Света.

Двухфазная кровяная среда Среда NNN.Агар готовят путем нагрева в колбе 1,4 г простого непитательного агара, 0,6 г NaCl и 90 мл дистиллированной воды. Нагреть содержимое колбы до расплавления агара; тщательно перемешивайте содержимое, в противном случае агар может пригореть на дне колбы.

Перенесите нужное количество расплавленного агара прямо в сосуды для культур. Стерилизовать агар автоклавированием культуральных пробирок при 121 °С в течение 15 минут. Дайте агару охладиться примерно до 50 °С и добавьте собранную в асептических условиях дефибринированную кровь кролика таким образом, чтобы конечная концентрация составляла примерно 15%. Перемешайте кровь и агар, вращая пробирки в вертикальном положении между ладонями. Поставьте пробирки в наклонное положение до затвердения агара, затем поставьте их в вертикальное положение и перенесите в холодильник или поместите в воду со льдом. Жидкая фаза – это вода, которая конденсируется на дне скошенного (косого) агара; никакую дополнительную жидкую фазу добавлять не нужно. Быстрое охлаждение свежеприготовленных “косячков” (пробирок со скошенным агаром) путем переноса в холодильник или ледяную воду способствует накоплению значительно бльшего количества конденсированной воды.

Среда USAMRU (агаровая среда Дифко, содержащая кровь). Это значительно более богатая среда, чем NNN, которая особенно полезна при выделении организмов, более прихотливых в отношении питательных веществ, например L. braziliensis. В качестве твердой фазы в 100 мл воды добавляют 4 г агаровой среды с кровью “Бакто” (Дифко). Метод приготовления такой же, как при применении среды NNN; если требуется дополнительная жидкость, можно добавить несколько капель стерильной дистиллированной воды.



Среда Tobie, модификация Evans. Эта богатая двухфазная среда использовалась для выделения самых разнообразных видов Leishmania Старого и Нового Света. Среда состоит из твердой фазы, включающей 0,3 г мясного экстракта, 0,5 г бактериологического пентона, 0,8 г NaCl, 2,0 агара и 100 мл дистиллированной воды. Смешать и нагреть ингредиенты, как в случае среды NNN. Перенести расплавленный агар в пробирки для культур и автоклавировать при 121 °С в течение 15 минут.

Охладить стерилизованный агар примерно до 55 °С, затем добавить дефибринированную лошадиную кровь (инактивированную нагреванием при 56 °С в течение 30 минут) так, чтобы конечная концентрация составляла около 15%. Смешать и приготовить "косячки" (среда со скошенным агаром). Жидкая фаза – это содержащий пролин сбалансированный солевой раствор. Добавить 0,2–0,3 мл жидкой фазы в агаровый косяк непосредственно перед инокуляцией.

Примечание относительно применения крови (кроме крови кроликов) в двухфазной среде. Довольно часто кроличью кровь бывает непросто достать для включения в двухфазные среды, например в среды NNN или USAMRU. В таких случаях может быть использована кровь других млекопитающих. Использовали овечью, лошадиную и человеческую кровь, но стоит экспериментировать с любой кровью, которая легко доступна. Если используется не кроличья кровь, она должна быть дефибринированной или в нее следует добавить антикоагулянт, но всегда инактивируйте кровь нагреванием (56 °С; 30 мин) и повышайте концентрацию агара в среде до 2%.

Проверка стерильности агаровой среды с кровью. Инкубируйте свежеприготовленную агаровую среду с кровью при 37 °С в течение 24 часов и исследуйте поверхность среды с целью выявления признаков бактериального роста. Немедленно выбрасывайте среду, в которой обнаруживаются такие признаки.

Хранение. Храните при 4 °С. Если нужна отдельная жидкая фаза, добавьте ее непосредственно перед использованием среды. Эти среды лучше всего использовать в течение 1 недели. Выбрасывайте после 3 недель хранения при 4 °С.

Среда Schneider Drosophila. Это коммерчески доступная, жидкая, содержащая культуру тканей насекомого среда, которая с добавлением 100, 200 или даже 300 мл/л фетальной телячьей сыворотки широко применяется для выделения и культивирования в больших объемах Leishmania spp. Это очень дорогая и в какой-то мере вариабельная методика. К 100 мл среды Schneider Drosophila (модифицированной) с Lглутамином добавьте 10, 20 или 30 мл инактивированной нагреванием (56 °С в течение 30 мин.) фетальной телячьей сыворотки.

Среды для поддержания роста и культивирования в больших объемах.

Для получения больших объемов культур жидкие среды более удобны, чем двухфазные. Среда MEM: FCS: EBLB – это богатая питательными веществами среда, пригодная для роста (но не для выделения) почти любого вида Leishmania. Она состоит из 100 мл минимальной эссенциальной среды с солями Эрла (модифицированная, автоклавированная), 3 мл раствора бикарбоната натрия (75 г/л), 5 мл бульона Evans’a с лизатом крови и 10 мл инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки.

Бульон Evans’a с лизатом крови готовится из 1,5 г триптозы, 1,0 г гидролизата казеина, 1,0 г продукта ферментативного переваривания печени, 0,15 г L-пролина, 0,68 г KH2PO4, 0,17 г NaOH и 100 мл дистиллированной воды. Чтобы конечный рН составлял 7,3–7,4, добавьте, если необходимо, или 1 моль/л HCl, или 1 моль/л NaOH. Растворите твердые ингредиенты в дистиллированной воде и стерилизуйте автоклавированием при 121 °С в течение 15 минут. После охлаждения добавьте 15 мл приготовленного в асептических условиях лизата крови, приготовленного из асептически собранной цельной крови (человеческая, лошадиная, овечья, козлиная и кроличья кровь, по-видимому, в равной мере пригодны) или введенной в антикоагулянт или дефибринированной.

Центрифугировать при примерно 3000 х g в течение 10 минут и удалить жидкую часть (сыворотку или плазму). Промыть эритроцитарную массу дважды ресуспендированием в равном объеме или стерильного изотонического солевого раствора или сбалансированного солевого раствора с пролином и повторно центрифугировать (3000 х g в течение 10 минут). Лизировать промытые кровяные клетки, добавляя равный объем стерильной дистиллированной воды. Тщательно смешать воду и клетки крови и использовать этот раствор в качестве лизата крови, который вводится в среду. Среда в этот момент будет мутной из-за клеточных остатков, добавленных с лизатом крови; для осветления среды следует применить асептическое центрифугирование при 15 000 x g в течение по меньшей мере 30 минут. Декантируйте всю прозрачную надосадочную жидкость, стараясь не разрушить осадок. Перенесите в колбу и храните надосадочную жидкость при 4 °С.

Полутвердые среды представляют ценность в качестве сред для транспортировки и для оживления больных культур.

Среда «Sloppy Evans” состоит из 80 мл сбалансированного солевого раствора с пролином, 0,1 г бактериологического пептона, 0,03 г мясного экстракта, 10 мл промытой эритроцитарной массы из лошадиной крови, 10 мл инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки и 0,3 г агара (простого, непитательного). Смешать все ингредиенты, за исключением эритроцитарной массы и фетальной телячьей сыворотки, в колбе или бутыли с завинчивающейся крышкой. Стерилизовать автоклавированием (121 °С в течение 15 минут), охладить до примерно 50 °С и добавить эритроцитарную массу и фетальную телячью сыворотку; хорошо перемешать и разлить, пока агар в расплавленном состоянии, по подходящим стерильным пробиркам для культур.

Полутвердая среда Locke, содержащая агар и кровь. Раствор Locke готовят из 9,2 г NaCl, 0,24 г CaCl2, 0,15 г NaHCO3, 0,42 г KCl, 1,0 г D-глюкозы и 1000 мл дистиллированной воды. Основа, включающая кровь и агар, состоит из 2,5 г агара (простого, непитательного), 1,0 г бактериологического пептона, 0,5 г NaCl и 100 мл дистиллированной воды. Смешивать семь частей раствора Locke с одной частью основы кровь-агар, довести рН до 7,4 и автоклавировать при 121 °С в течение 15 минут. Оставить охлаждаться примерно до 50 °С и добавить дефибринированную кроличью кровь до концентрации примерно 10%.

Тщательно перемешать, затем разлить по стерильным сосудам для выращивания культур.



Pages:     | 1 |   ...   | 32 | 33 || 35 |
 

Похожие работы:

«СОДЕРЖАНИЕ 1. Основные сведения о вузе (организации) 2. Показатели научного потенциала вуза (организации) 2.1. Финансирование и выполнение научных исследований и разработок Таблица 1. Финансирование научных исследований и разработок Таблица 2. Финансирование научных исследований и разработок из средств министерств, федеральных агентств, служб и других ведомств. 11 Таблица 3. Финансирование и выполнение научных исследований и разработок из средств Минобрнауки России Таблица 4. Финансирование и...»

«ДЕЛО № Учебно-методический комплекс дисциплины ГЕОПОЛИТИКА 1. Направления подготовки бакалавров: 080100 Экономика 2. Специальности: 080102 (060600) Мировая экономика Всего папок в деле: _ Номер папки: _ Преподаватель: ст. преподаватель _ С.В. Шагурин Санкт–Петербург 2007 Геополитика Учебно-методический комплекс разработан для студентов очного и очно-заочного отделения, направления 080100 Экономика и специальности 080102 Мировая экономика. СПб: СПбГПУ, 2006 Учебно-методический комплекс...»

«Глава I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Статья 1. Отношения, регулируемые Кодексом внутреннего водного транспорта Российской Федерации 1. Настоящий Кодекс регулирует отношения, возникающие между организациями внутреннего водного транспорта Российской Федерации, грузоотправителями, грузополучателями, пассажирами и другими физическими и (или) юридическими лицами при осуществлении судоходства на внутренних водных путях Российской Федерации, и определяет их права, обязанности и ответственность. 2. Положения...»

«Мякиньков Юрий Павлович ведущий разработчик ЛБВ Наукоград Фрязино 2009-2013 Для обороны страны и освоения космоса 2 УДК 621.37 ББК 47 Р38 Ровенский Г.В. Мякиньков Юрий Павлович - ведущий разработчик ЛБВ. Серия - Ученые наукограда. Фрязино, 2013. Представлена биография Юрия Павловича Мякинькова (1929-1997), к.т.н., лауреата Ленинской премии, разработчика ламп бегущей волны (ЛБВ) широкополосных усилителей СВЧ для военной аппаратуры и спутников связи. Выпускник Горьковского университета, сотрудник...»

«GSM СИСТЕМА ОПОВЕЩЕНИЯ ЭЛЕМЕНТ-1112 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ 2008 г. Руководство по эксплуатации г. Москва, Изд. ООО Навтелеком, Ред. 1.1, 2008 г. 2 Уважаемый Покупатель! В данном Руководстве по эксплуатации изложены основные вопросы, связанные с установкой, проверкой и настройкой, а также эксплуатацией GSM системы оповещения ЭЛЕМЕНТ. Настоятельно рекомендуется перед монтажом устройства и его эксплуатацией внимательно изучить данный документ. Перед монтажом устройства ЭЛЕМЕНТ необходимо...»

«Руководство Пользователя Монтажник Пользователь Техник 0 Уважаемый Клиент, Поздравляем с приобретением Вами высококачественного котла Immergas, разработанного для обеспечения длительной, комфортабельной и безопасной эксплуатации. В качестве клиента Immergas Вы можете рассчитывать на профессиональный Уполномоченный Центр Обслуживания, квалифицированный персонал, что обеспечит постоянный уход и эффективную работу Вашего котла. Читайте следующие страницы внимательно, поскольку они содержат важную...»

«Совет по торговле и развитию Комиссия по торговле и развитию Четвертая сессия Женева, 1216 ноября 2012 года Пункт 4 предварительной повестки дня Расширение и укрепление синергизма между тремя основными направлениями деятельности Доклад о ходе осуществления положений Аккрского соглашения, касающихся ключевых вопросов торговли и развития Записка секретариата ЮНКТАД Резюме В пункте 201 Аккрского соглашения отмечается, что роль комиссий заключается, в частности, в дальнейшем расширении и укреплении...»

«История отечественных управляющих вычислительных машин (1955—1987 гг.) Под редакцией д.т.н, профессора Я. А. Хетагурова Москва, 2011 г. Аннотация Появление этой книги по истории отечественных управляющих вычислительных машин (УВМ) непосредственно связано с 11-летней деятельностью Экспертного совета Виртуального компьютерного музея (www.computer-museum.ru), организованного Э. М. Пройдаковым. В книге впервые приведены собранные в музее уникальные данные по отечественным УВМ, которые были созданы...»

«Практикум оценочной деятельности Москва 2009 Рецензенты: А.Г. Грязнова, Президент Аудиторской Палаты России (АПР),Президент Финансовой Академии при правительстве РФ, Заместитель Председателя Высшей аттестационной комиссии Министерства образования РФ, Президент Гильдии финансистов, Вице-президент Академии менеджмента и рынка Член Ассоциации российских банков, Член Международной налоговой ассоциации Член Делового клуба Азиатско-тихоокеанского экономического сотрудничества (АТЭС), доктор...»

«И.В. Еркомайшвили ОСНОВЫ ТЕОРИИ ФИЗИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ Курс лекций Научный редактор доцент, канд. пед. наук О.Л.Жукова Екатеринбург, 2004 СОДЕРЖАНИЕ Ведение..6 Тема 1. Основные понятия теории физической культуры.7 Тема 2. Структура и функции физической культуры..15 Тема 3. Теория и методика физической культуры как наука и учебная дисциплина..21 Тема 4. Физическая культура как социальная система. Цели, задачи и основы функционирования физической культуры в обществе..25 Тема 5. Средства...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.