WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 25 | 26 || 28 | 29 |   ...   | 49 |

«Т. Г. Волова БИОТЕХНОЛОГИЯ Ответственный редактор академик И. И. Гительзон Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в ...»

-- [ Страница 27 ] --

Генноинженерными методами за короткий срок были созданы микроорганизмы-суперпродуценты, позволяющие получать с высокими выходами ряд белков вирусов и животных. Созданы штаммы, у которых до 20 % клеточного белка составляют генноинженерные продукты, например, коровий антиген вируса гепатита В, главный капсидный антиген вируса ящура, реннин теленка, поверхностный антиген вируса гепатита В и др.

Получение рекомбинантного инсулина Гормон инсулин построен из двух полипептидных цепей, А и Б, длиной 20 и 30 аминокислот соответственно. Последовательность цепей была установлена в 1955 г. Сэнгером. Синтез обеих цепей, включающий химических реакций, в 1963 г. был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным. Получали инсулин до 1980 г. за счет выделения его из поджелудочной железы (поджелудочная железа коровы весит 200–250 г., а для получения 100 г кристаллического инсулина требуется до 1 кг исходного сырья). Поэтому потребности в нем удовлетворяли не полностью. Так, в 1979 г. из 6 млн. зарегистрированных больных сахарным диабетом инсулин получали только 4 млн. человек. В 1980 г. датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты. В организме животного две полипептидные цепи исходно являются частями одной белковой молекулы длиной 109 аминокислот – это препроинсулин. При синтезе в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для транспорта молекулы сквозь мембрану клетки. Эти аминокислоты отщепляются, и образуется проинсулин длиной 86 аминокислот.

В 1980 г. Гилберт с коллегами выделили мРНК инсулина из опухоли клеток поджелудочной железы крысы (в то время не разрешали манипулировать генами человека) (рис. 4.3). Полученную ДНК-копию мРНК встроили в плазмиду pBR 322, в среднюю часть гена пенициллиназы (фермент в норме выделяется из клетки), которую транспортировали в бактерию. Сконструированная плазмида, как оказалось, содержала информацию о структуре проинсулина, а не препроинсулина. При трансляции мРНК в клетках E. coli синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Гормон из этого белка выщепляли трипсином. Было доказано, что полученный таким образом белок влияет на сахарный обмен аналогично гормону поджелудочной железы. В 1979 г. в США в течение трех месяцев синтезировали гены, кодирующие А- и В-цепи инсулина; гены были собраны из 18 и 11 олигонуклеотидов соответственно. Далее гены были встроены, как и при получении соматостатина, в плазмиду в конце гена -галактозидазы кишечной палочки.

В клетках E. coli также осуществлен синтез проинсулина, а не только его отдельных цепей. На выделенной матричной мРНК синтезировали ДНК-копию. Синтез проинсулина имеет определенные преимущества, так как процедуры экстракции и очистки гормона минимальны.

Совершенствование техники получения генноинженерных штаммовпродуцентов с помощью различных приемов (амплификацией плазмид, инкапсулированием вводимых рекомбинантных ДНК, подавлением протеолитической активности реципиентных клеток) позволило получить высокие выходы гормона, до 200 мг/л культуры. Медико-биологические и клинические испытания генноинженерного белка показали пригодность препарата, и в 1982 г. он был допущен к производству во многих странах.

Рис. 4.3. Биосинтез инсулина крысы в сконструированных клетках E. coli а) карта плазмиды pBR322 c двумя генами – пенициллиназы и устойчивости к тетрациклину;

б) карта, полученная при определении последовательности кДНК рекомбинантной плазмиды в продуцирующем инсулин клоне E. coli; в) гибридный белок; г) биологически активный инсулин Биосинтез соматотропина Соматотропин (гипофизарный гормон роста) впервые был выделен в 1963 г. из трупного материала. Выход гормона из одного гипофиза составлял около 4–6 мг в пересчете на готовый фармацевтический препарат.

Для лечения карликовости необходимая доза составляет 6 мг в неделю в течение года. Кроме недостатка по массе, получаемый экстракцией препарат был гетерогенным, против него вырабатывались антитела, которые сводили на нет действие гормона. Более того, существовала опасность, Рис. 4.4. Схема конструирования гена соматотропина комбинацией химического синтеза что при получении препарата могло произойти заражение организма медленно развивающими вирусами. Поэтому дети, получавшие данный препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Генноинженерный препарат имеет несомненные преимущества: доступен в больших количествах, гомогенен, не содержит вирусов. Синтез соматотропина, состоящего из 191 аминокислотного остатка, был осуществлен в США Гедделем с сотрудниками в 1979 г. (компания «Генентек») (рис. 4.4).

При химико-ферментном синтезе ДНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, поэтому был выбран специальный путь клонирования. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестиктазами получали последовательность, кодирующую всю аминокислотную последовательность гормона, кроме первых 23 аминокислот. Далее клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий этим 23 аминокислотам со стартовым ANG кодоном в начале. Два полученных фрагмента соединяли и подстраивали к паре lacпромоторов и участку связывания рибосом. Сконструированный ген трансплантировали в E. coli. Синтезированный в бактериях гормон обладал требуемой молекулярной массой, не был связан с каким-либо белком;



его выход составлял около 100 000 молекул на клетку. Гормон, однако, содержал на N-конце полипептидной цепи дополнительный остаток метионина; при удалении последнего выход гормона был низким.

В 1980 г. были получены доказательства того, что генноинженерный соматотропин обладает биологической активностью нативного гормона.

Клинические испытания препарата также прошли успешно. В 1982 г. гормон был получен также на основе сконструированной кишечной палочки в Институте Пастера в Париже. Стоимость гормона к 1990 г. снизилась до 5 долларов/ед. В настоящее время его начинают применять в животноводстве для стимулирования роста домашнего скота, удоев и др.

Получение интерферонов Интерфероны – группа белков, способных продуцироваться в ядерных клетках позвоночных. Это мощные индуцибельные белки, являющиеся фактором неспецифической резистентности, поддерживающего гомеостаз организма. Система интерферонов обладает регуляторной функцией в организме, так как способна модифицировать различные биохимические процессы. Интерфероны позвоночных, в том числе человека, разделяют на три группы:,,, соответственно, лейкоцитарные, фибробластные и иммунные.

В конце 70-х гг. стала очевидной потенциальная значимость интерферонов для медицины, в том числе профилактики онкологических заболеваний. Клинические испытания сдерживались отсутствием достаточных количеств интерферонов и высокой стоимостью препаратов, полученных традиционным способом (выделение из крови). Так, в 1978 г. для получения 0.1 г чистого интерферона в Центральной лаборатории здравоохранения Хельсинки (лаборатория – мировой лидер по производству интерферона из лейкоцитов здоровых людей) получали при переработке 50 000 л крови. Полученное количество препарата оценочно могло обеспечить лечение против вирусной инфекции 10 000 случаев. Перспективы получения интерферонов связывали с генной инженерией.

В 1980 г. Гилберту и Вейссману в США удалось получить интерферон в генетически сконструированной E. coli. Исходная трудность, с которой они столкнулись, – низкий уровень мРНК в лейкоцитах, даже стимулированных заражением вирусом. При переработке 17 л крови удалось выделить мРНК и получить ДНК-копию. Последнюю встроили в плазмиду и клонировали в E. coli. Было испытано свыше 20 000 клонов. Отдельные клоны были способны к синтезу интерферона, но с низким выходом, 1– молекулы на клетку. Аналогичные исследования проводили в Японии, Англии, Франции, России.

В 1980 г. были установлены нуклеотидные последовательности - и интерферонов: мРНК фибробластного интерферона состоит из 836 нуклеотидов; из них 72 и 203 нуклеотида приходятся на 5’- и 3’нетранслируемые области, 63 кодируют пептид, ответственный за секрецию интерферона из клеток и 498 нуклеотидов кодируют 166 аминокислотных остатков собственно интерферона. После этого химическим синтезом были получены гены - и -интерферонов, которые клонировали в E. coli. В 1981 г. была расшифрована нуклеотидная последовательность иммунного интерферона, существенно отличающегося от первых двух, но сравнимого по величине молекулы. Существенным моментом был полный синтез гена лейкоцитарного интерферона человека, осуществленный в Великобритании сотрудниками фирмы «Империал кемикал индастри» и Школы биологических наук Лестерского университета. В течение полутора лет была синтезирована полная последовательность ДНК-копии интерферона, способная кодировать 1-интерферон. Синтез олигонуклеотидов был осуществлен новым методом, существенно ускорившим синтез гена.

Вначале к полиакриламидной смоле был присоединен нуклеотид; далее проводили присоединение пар нуклеотидов, используя конденсирующий агент в безводном пиридине. Каждый цикл длился полтора часа, поэтому в течение года можно было синтезировать последовательность длиной в 5000 нуклеотидов. Было синтезировано 67 олигонуклеотидов, которые с помощью лигазы соединили в двунитевую ДНК, состоящую из 514 пар нуклеотидов. Полученный ген встраивали в клетки двух бактерий: E. coli, Methylophilus methylotrophus, и была получена экспрессия.

Усилия, направленные на получение генноинженерных интерферонов, по сравнению с методом культуры клеток позволили снизить затраты более чем в 100 раз. Были получены различные типы интерферонов на основе генноинженерных клеток бактерий и дрожжей. Это позволило развернуть медико-биологические и клинические испытания препаратов. Получаемые в течение 1980–1981 гг. препараты интерферонов были очищены на 80 % и обладали удельной активностью более 107 международных единиц на 1 мг белка. Расширение клинических испытаний интерферонов, начатых в этот период, зависит от повышения степени его очистки. Прогресс в этом направлении был достигнут применением моноклональных антител, которые можно использовать для аффинной хроматографии (при этом нужные белки задерживаются на колонке с антителами).

4.3. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Традиционно для получения более активных биологических агентов применяли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов.

Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др.

микроорганизмов. Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 106–108, чтобы возникала мутация.

К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцированный мутагенез (резкое увеличение частоты мутаций биологического объекта при искусственном повреждении генома). Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ряд химических соединений (азотистая кислота, бромурацил, антибиотики и пр.). После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку.



Pages:     | 1 |   ...   | 25 | 26 || 28 | 29 |   ...   | 49 |
 



Похожие работы:

«Информационно-аналитический бюллетень №2 Москва 2005 Информационно-аналитический бюллетень ЦПИ ИМЭПИ РАН 2005 - №2 Центр проблем интеграции Института международных экономических и политических исследований Российской академии наук Информационно-аналитический бюллетень №2 Москва 2005 2 Информационно-аналитический бюллетень ЦПИ ИМЭПИ РАН 2005 - №2 Центр проблем интеграции создан по инициативе Национального инвестиционного совета (НИС) и Российской академии наук (РАН) в Институте международных...»

«В Е С Т Н И К КрасГАУ Выпуск 3 Красноярск 2013 Редакционный совет Н.В. Цугленок – д-р техн. наук, проф., чл.-корр. РАСХН, действ. член АТН РФ, лауреат премии Правительства в области науки и техники, международный эксперт по экологии и энергетике, засл. работник высш. школы, почетный работник высш. образования РФ, ректор – гл. научный редактор, председатель совета – канд. техн. наук, проф., засл. энергетик РФ, чл.-корр. ААО, СО МАН ВШ, федер. Я.А. Кунгс эксперт по науке и технике РИНКЦЭ...»

«НУРБЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ГУЛИА УДИВИТЕЛЬНАЯ МЕХАНИКА В ПОИСКАХ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ КАПСУЛЫ ОТ РЕДАКЦИИ Проблеме создания совершенного накопителя энергии, образно названного автором энергетической капсулой, посвящены сотни научных трудов и десятки книг Нурбея Гулиа – ученого, чьи работы получили признание как в России, так и за рубежом. Энергетика всегда была и остается приоритетным направлением науки и техники, а накопители энергии – важным и перспективным разделом энергетики. Эффективное накопление...»

«Аннотации рабочих программ по на правлению 110800.62 Агроинженерия профиль Электрооборудование и электротехнологии в АПК Аннотация программы дисциплины ИНОСТРАННЫЙ ЯЗЫК 1 курс. Дисциплина иностранный язык является частью гуманитарного цикла дисциплин подготовки студентов по направлению подготовки бакалавров в области Агроинженерия. Дисциплина реализуется в институте Энергетики и управления энергетическими ресурсами АПК кафедрой иностранных языков. Дисциплина нацелена на формирование...»

«Физические положения и математические преобразования, изложенныe в работе, достаточно просты, они на уровне второго курса ВТУЗa. Я и стремился к тому, чтобы работа была максимально простой, ясной и понятной, не загроможднной формулами. Работа основана на наблюдаемых явлениях, часть из которых изложена, а многиe, не вошедшие, принципиально объяснимы. Аннотация В работе описываются, равноправно с однородным, обычным ходом времени, условия перехода и возможность неоднороднoгo, отклоннного хода...»

«ИБРАГИМОВ ЖАЛИЛ ДУСМУРАТОВИЧ УДК 539.104:535:34:548.73 РАДИАЦИОННО-СТИМУЛИРОВАННЫЕ ЭФФЕКТЫ В КРИСТАЛЛАХ КВАРЦА И БЕРЛИНИТА С РАЗЛИЧНЫМ ТИПОМ И СТЕПЕНЬЮ СОВЕРШЕНСТВА СТРУКТУРЫ Специальностью 1.04.07 - Физика твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук ТАШКЕНТ-2001 Работа выполнена в Институте Ядерной Физики Академии на\ к Республики Узбекистан Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, академик АН РУ...»

«Итоговый отчет II: Методики и инструменты составления кадастров выбросов СO2 в городах Авторы: Paolo Bertoldi, Damin Borns Cayuela, Suvi Monni, Ronald Piers de Raveschoot -1СОДЕРЖАНИЕ ВСТУПЛЕНИЕ 2 1. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ МЕТОДИК СОСТАВЛЕНИЕ КАДАСТРОВ ВЫБРОСОВ СO2 3 2. ИМЕЮЩИЕСЯ МЕТОДИКИ ОЦЕНИВАНИЯ ВЫБРОСОВ СO2/ СОКРАЩЕНИЯ ВЫБРОСОВ 4 3. СВОДНЫЕ ДАННЫЕ О СУЩЕСТВУЮЩИХ МЕТОДИКАХ 20 4. КАДАСТРЫ, ПРЕДУСМОТРЕННЫЕ СОГЛАШЕНИЕМ МЭРОВ 22 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИМЕЮЩИХСЯ МЕТОДИК С...»

«Характерный поступок Данилы Филипповича Уважение к письменному тексту в русском человеке непоправимо отсутствует. Считаясь едва ли не самым читающим народом в мире, мы внутренне не доверяем книгам, прекрасно зная, что даже если авторы этих книг – порядочные и искренние люди, текстовая отливка их мыслей заведомо искажена: книга – это книга, а человек – это человек – размышляем мы про себя, с недоверием оглядывая толстые фолианты. Для того, чтобы их написать, гениальным быть вовсе не нужно –...»

«Augusta Goldin OCEANS OF ENERGY Reservoir of Power for the Future Harcourt Brace Jovanovich / New York and London Аугуста Голдин ОКЕАНЫ ЭНЕРГИИ Источники энергии будущего Перевод с английского И. Бочаровой Издательство Знание Москва, 1983 Аугуста Голдин 2 ББК 31.55 Г60 Аугуста Голдин Г60 Океаны энергии.– Пер. с англ.– М.: Знание, 1983.– 144 с, ил. 25 к. 50 000 экз. Книга посвящена промышленному использованию энергии, заключенной в океане. Автор рассказывает о приливных электростанциях,...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.