WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 23 | 24 || 26 | 27 |   ...   | 49 |

«Т. Г. Волова БИОТЕХНОЛОГИЯ Ответственный редактор академик И. И. Гительзон Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в ...»

-- [ Страница 25 ] --
При оптимизации любого биотехнологического процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия обычно направлены на улучшение их генетических свойств. Традиционно для этих целей использовали мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. Сегодня в этой области произошли громадные перемены. В настоящее время разрабатываются и применяются принципиально новые методы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК. Модификация генетического материала осуществляется разными методами: в живом организме (in vivo) и вне его (in vitro), соответственно, это два направления – клеточная инженерия и генетическая инженерия.

С помощью этих методов возможно получение новых высокопродуктивных продуцентов белков и пептидов человека, антигенов, вирусов и др.

Развитие генетической и клеточной инженерии приводит к тому, что биотехнологическая промышленность все шире и шире завоевывает новые области производства. Фундаментом для возникновения новейших методов биотехнологии послужили открытия в генетике, молекулярной биологии, генетической энзимологии, вирусологии, микробиологии и других дисциплинах.

4.1. МЕТОДЫ И ВОЗМОЖНОСТИ

ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Быстрое внедрение новейших фундаментальных достижений в практику и существенное влияние последних на уровень теоретических исследований, свойственные биотехнологии, наиболее наглядно проявляются на примере развития генетической инженерии.

Важнейшим этапом для развития биотехнологии было выделение в середине текущего столетия молекулярной биологии в самостоятельную дисциплину. Возникновение молекулярной биологии стало возможным благодаря взаимодействию генетики, физики, химии, биологии, математики и др. Э. Чаргофф и З. Д. Хочкис, исследуя молекулярные соотношения нуклеотидных оснований в ДНК (аденин, гуанин, цитозин, тимин) показали, что у различных организмов они одинаковы. Это открытие сыграло ключевую роль в установлении структуры ДНК. Большую роль в расшифровке структуры ДНК сыграл прогресс в области генетики бактерий и бактериофагов. Было установлено (А. Херши, М. Чейз, Дж. Ледерберг, Н. Циндер), что трансдукция (перенос генетического материала) может осуществляться с помощью бактериофага, а фаговой ДНК может принадлежать роль носителя наследственности. Б. Хейсом были выяснены также закономерности полового процесса у бактерий (конъюгация), при котором из донорских клеток, имеющих F-фактор (фертильность) генетический материал переносится в реципиентные клетки. Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили комплиментарную модель строения ДНК и механизм ее репликации; было раскрыто уникальное свойство ДНК – способность самовоспроизведения (репликация).

На базе молекулярной биологии и генетики микроорганизмов к началу 60-х гг. сформировалась молекулярная генетика. Г. Гамов в 1954 г. выдвинул гипотезу о том, что каждый кодон (последовательность нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту) должен состоять из трех нуклеотидов. В 1961 г. было подтверждено экспериментально, что первичная структура белка закодирована в ДНК в виде последовательности нуклеотидных триплетов (кодонов), каждая из которых соответствует одной из 20 аминокислот. К 1966 г. удалось получить данные о строении генетического кода.

Следующим был вопрос о том, как переносится информация с ДНК, находящейся в ядре, в цитоплазму, где реализуется синтез белка на рибосомах.

Было установлено, что последовательность триплетных кодонов, хранящаяся в ДНК, транскрибируется (переписывается ) в недолговечные молекулы информационной РНК (иРНК). Данный этап ДНК иРНК был назван транскрипцией, а этап иРНК белок – трансляцией. Перенос аминокислоты и определение ее местонахождения в синтезирующейся белковой молекуле осуществляет транспортная РНК (тРНК). На ДНК, как на матрице, синтезируется РНК, а на РНК – белок. У некоторых вирусов отсутствует первое звено, и РНК служит для них материалом наследственности.

Механизм контроля генной активности долгое время оставался неизвестным. Большое значение имели работы Ф. Жакоба и Ж. Моно, показавшие, что у бактерий есть структурные гены, дающие информацию о синтезе определенных белков и регуляторные гены, которые осуществляют включение или выключение отдельных генов или их блоков. Далее выяснилось, что регуляция генов по этому принципу имеет место и у других организмов. Существуют также иные механизмы регуляции.

Следующим важным шагом было проведение работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей (секвенирование), которое дает информацию о первичной структуре участка генома, выполняющего определенные функции. Структура и функции приобрели общее молекулярнобиологическое выражение, его суть заключается в том, что функциональные состояния выражают структурные изменения макромолекул и ассоциаций.

От изучения закономерностей функционирования генетического материала в клетке вскоре исследователи перешли к генетическим манипуляциям. Возникла новая экспериментальная технология, заключающаяся в введении в клетки чужеродных генов. Названия «генетическая (или генная) инженерия» или «работа с рекомбинантными ДНК» эквивалентны.

Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.

В 1972 г. Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага dvgal с галактозным опероном E. coli. Инструментом для генетического конструирования стали две группы ферментов – рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы. Первые необходимы для получения однородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех генноинженерных манипуляций.



Техника генетического конструирования in vitro включает несколько последовательных процедур (рис. 4.1):

1) получение нужного гена;

2) встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);

3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

4) идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

CT TAAG

GAATTC

AA TT AA TT

T T AA T T AA

Рис. 4.1. Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках Плазмида E.coli расщепляется рестриктазой в обеих частях ДНК с образованием на концах неспаренных нуклеотидов (ТТАА или ААТТ). Ген выщеплен с помощью этой же рестриктазы с образованием на концах, комплиментарных плазмиде, последовательностей (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают с помощью лигазы. Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон, все клетки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной Получение генов Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов.

Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие.

Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген.

Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК. На рис. 4.2 показана схема такой машины, сконструированной канадской фирмой «Био лоджикэлс».

Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нуклеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполнена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скоростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и Вцепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.

Рис. 4.2. Схема «генной машины» (по Д. Хопвуду, 1984).

Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.

Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина).

Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена.

Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК При обычном введении в бактериальную клетку ДНК подвергается ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при введении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – реплицироваться. Вектор также несет в своем составе генетический признак, необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устойчивости к антибиотикам.



Pages:     | 1 |   ...   | 23 | 24 || 26 | 27 |   ...   | 49 |
 



Похожие работы:

«Кафедра Инженерная кибернетика. Специальность Автоматизация и управление. Допущен к защите Зав. кафедрой_ __2014. МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ пояснительная записка Тема: Моделирование и исследование системы ориентации искусственного спутника Земли. Магистрант Бишманова А.К. подпись (Ф.И.О.) Руководитель диссертации Федоренко И.А. подпись (Ф.И.О.) Рецензент Волобуева О.П. подпись (Ф.И.О.) Нормоконтроль Копесбаева А.А. подпись (Ф.И.О.) Алматы, 2014г. 4 Некоммеческое акционерное общество...»

«Перевод с английского С. Поповича Тайберонн Джеймс Т12 Говорит Метатрон: Беседы с Архангелом / Перев. с англ. — М.: ООО Издательство София, 2010. — 288 с. ISBN 978-5-399-00131-9 Путешественник, геолог, музыкант, мистик и ченнелер, восходящая звезда современной метафизики Джеймс Тайберонн собрал в этой книге самые интересные и актуальные послания от Архангела Метатрона. Здесь обсуждаются такие темы, как планетарные энергетические решетки, лей-линии, места силы, целительные камни, сакральная...»

«УДК 658.514 СНИЖЕНИЕ ПОЖАРНОЙ И ПРОМЫШЛЕННОЙ ОПАСНОСТИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В НЕФТЕГАЗОВОЙ ОТРАСЛИ ПУТЕМ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОЛОГИИ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРЕНАЖЕРНОЙ ПОДГОТОВКИ ПЕРСОНАЛА Хафизов Ф.Ш., Шевченко Д.И., Кудрявцев А.А. Уфимский государственный нефтяной технический университет, г.Уфа Кафедра Промышленной и пожарной безопасности e-mail: atp_mail@inbox.ru Аннотация. В статье рассматриваются проблемы, связанные с оценкой эффективности тренажеров для специалистов нефтегазового сектора. В...»

«Система эффективного смазывания Автоматические лубрикаторы Klbermatic Необходимый смазочный материал в нужное время в нужном месте 3 Автоматическая смазка с помощью Klbermatic - Ваши преимущества с первого взгляда 4 Оптимальное решение для каждого применения 5 Klbermatic NOVA 8 Klbermatic STAR VARIO 10 Klbermatic STAR CONTROL TIME 12 Klbermatic Basis Kits 14 2 B994006012 / Издание 04.13 Необходимый смазочный материал в нужное время в нужном месте Всё зависит от правильного смазывания Смазочный...»

«ДЖИБУТИ ЗУРАБ ВЛАДИМИРОВИЧ “МЕХАНИЗМЫ ИМПУЛЬСНОГО ФОТОННОГО ОТЖИГА В ПОЛУПРОВОДНИКАХ С КОВАЛЕНТНЫМИ И СМЕШАННЫМИ СВЯЗЯМИ” (01.04.07 – физика конденсированных сред) Диссертация представленная на соискание ученой степени доктора физико-математических наук. Научный консультант: Н.Д.Долидзе, доктор физикоматематических наук. 2006 г 2 СОДЕРЖАНИЕ Содержание. Используемые в диссертационной работе сокращения и обозначения. Введение. ГЛАВА I АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1.Ионная имплантация, как...»

«.В о время существования советской власти в России, когда еще существовал построенный на века великий, могучий Советский Союз, с утра до вечера неслись из приемников и телевизоров бодрые, энергичные голоса коммунистической пропаганды, прославляющие величие и счастье жизни в мире социализма и посылающие проклятья миру загнивающего капитализма. В изданиях книг и газет, в кино, на всех углах улиц, площадей и, как правило, на крышах более-менее высоких зданий мы видели лозунги того же содержания, а...»

«Аннотация Эти биографические очерки были изданы около ста лет назад отдельной книгой в серии Жизнь замечательных людей, осуществленной Ф. Ф. Павленковым (1839—1900). Написанные в новом для того времени жанре поэтической хроники и историко-культурного исследования, эти тексты сохраняют по сей день информационную и энергетико-психологическую ценность. Писавшиеся для простых людей, для российской провинции, сегодня они могут быть рекомендованы отнюдь не только библиофилам, но самой широкой...»

«Заведующий кафедрой: академик РАН, профессор Урусов В.С. Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ермин Н.Н. Рецензент: доктор химических наук, профессор Белоконева Е.Л. Москва 2014 Оглавление Введение 3 Цели курсовой работы 4 Глава 1. Литературный обзор 5 1.1. Метод атомистических парных потенциалов 5 1.2 Особенности программы GULP 7 1.3 Особенности программного пакета TOPOS 9 Глава 2. Кристаллохимия боратов и их аналогов 10 2.1. Общая кристаллохимия боратов 10 2.2. Аналоги...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.