WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 20 | 21 || 23 | 24 |   ...   | 49 |

«Т. Г. Волова БИОТЕХНОЛОГИЯ Ответственный редактор академик И. И. Гительзон Рекомендовано Министерством общего и профессионального образования Российской Федерации в ...»

-- [ Страница 22 ] --

Разделение может быть достигнуто адсорбционным или ковалентным связыванием фермента с нерастворимыми носителями, либо связыванием отдельных молекул фермента с образованием агрегатов. При иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, так как этот процесс препятствует денатурации белков. Иммобилизованный фермент, имеющий ограниченную возможность для конформационных перестроек, быстрее растворимого находит кратчайший путь к функционально активной конформации. Иммобилизованные ферменты приобретают, помимо стабильности, отдельные свойства, не характерные для их свободного состояния, например, возможность функционировать в неводной среде, более широкие зоны оптимума по температуре и рН. По образному выражению А. М. Егорова (1987) «Иммобилизованные ферменты как гребцыневольники на галерах, прикованные каждый к своей скамье, пространственно разобщены на носителе. Это означает резкое затруднение межмолекулярных взаимодействий типа агрегации, которые могут вызвать инактивацию фермента». При этом фермент из разряда гомогенных катализаторов переходит в разряд гетерогенных, то есть находится в фазе, не связанной ни с исходным субстратом, ни с образуемым продуктом. Это позволяет организовывать на базе иммобилизованных ферментов различные более эффективные биотехнологические процессы многократного периодического, а также непрерывного действия с использованием принципа взаимодействия подвижной и неподвижной фаз.

Длительность сохранения каталитической активности и ряд свойств ферментов определяются правильностью выбора носителя, метода и условий проведения иммобилизации. Существует несколько принципиально различных подходов, позволяющих связать фермент с носителем:

адсорбционные методы и методы химического связывания на поверхности, методы механического включения или захвата, методы химического присоединения (рис. 3.2).

Методы иммобилизации путем адсорбции основаны на фиксировании фермента на поверхности различных материалов – неорганических (силикагель, пористое стекло, керамика, песок, обожженная глина, гидроокиси титана, циркония, железа) и органических (хитин, целлюлоза, полиэтилен, ионообменные смолы, вспененная резина, полиуретан с ячеистой структурой). Насколько разнообразны материалы, применяемые для адсорбции ферментов, настолько различны механизмы и прочность связывания фермента с носителем. Характеризуя эти связи, можно говорить о широком их спектре, от простого обрастания носителя до образования полярных, ионных и ковалентных связей. Адсорбция – это самый простой метод имБ Рис. 3.2. Основные методы иммобилизации ферментов.

А – абсорбция на крупнопористом носителе; Б – ковалентное связывание; В – адсорбция;

мобилизации ферментов на поверхности нерастворимых носителей.

Процедура иммобилизации состоит в смешивании в определенных условиях фермента с носителем и инкубации смеси. Затем при помощи фильтрования и центрифугирования проводят отделение нерастворимого компонента смеси от растворимого. В процессе адсорбции фермента на носителе при их взаимодействии возникают солевые связи, а также другие слабые взаимодействия (водородные, ван-дер-ваальсовы). Адсорбция – мягкий метод иммобилизации, при котором влияние носителя на активность фермента минимально, поэтому, как правило, ферменты хорошо сохраняют активность. Недостаток данного метода – непрочность связей.

Поэтому при незначительном изменении условий среды (рН, температуры, ионной силы, концентрации продукта) возможна десорбция фермента с поверхности носителя. Более прочными являются связи, основанные на ионном взаимодействии, когда адсорбция поддерживается при определенных значениях рН и ионной силе омывающего фермент раствора.

Методы химического связывания имеют долгую историю и реализуются в различных модификациях. Практически все функциональные группы белков могут быть использованы для связывания катализатора с носителем. Широкое применение нашли реакции, ведущие в присутствии водоотнимающего агента к образованию пептидных связей между аминогруппами фермента и карбоксильными группами носителя или, наоборот, – между карбоксильными группами фермента и аминогруппами носителя.

В качестве водоотнимающего агента используют дициклогексилкарбодиимид, сшивающим агентом может служить бромциан. Возможно проведение сшивки без участия сшивающих агентов. Перспективным подходом в развитии данного метода является использование в качестве носителя привитых полимеров. Прививая к поверхности полимерного материала боковые ветви, можно регулировать его свойства и влиять на реакционную способность за счет создания на поверхности носителя микросооружений, оптимальных для стабильного функционирования биокатализатора. Пример такого подхода – применение полиэтилена с привитыми поливиниловым спиртом или полиакриловой кислотой. С целью снижения диффузионных затруднений между субстратом и ферментом, а также для облегчения оттока образующихся продуктов, при иммобилизации можно выводить фермент из микросооружения молекулы носителя. Фермент присоединяют к поверхности носителя через некоторую, определенной длины, химическую последовательность, так называемый спейсер («поясок»).

Иммобилизация путем химической сшивки фермента с носителем характеризуется высокой эффективностью и прочностью связи. Для предотвращения снижения каталитической активности фермента место сшивки удаляют от активного центра катализатора и присоединение проводят не по белковой части молекулы, а по углеводной.

Одним из наиболее эффективных методов иммобилизации с образованием химических связей считают образование ковалентных связей между молекулой носителя и катализатором. Как правило, для ковалентного присоединения носитель нужно предварительно активировать (активацию аффинных носителей проводят, например, бромцианом). Более простым, не требующим предварительной модификации носителя и быстрым методом иммобилизации в простых условиях является металлохелатный метод. Он заключается в иммобилизации ферментов на носителях из полимеров гидроксидов металлов (титана, циркония, олова, железа). Гидроксильные группы вытесняются из координационной сферы того или иного металла функциональными группами фермента, в результате между носителем и ферментом возникает координационная или ковалентная связь. Успех метода определяется рядом условий: в молекуле фермента должны присутствовать группы, играющие роль лигандов и способные стерически контактировать с атомами титана; данные группы должны быть удалены от активного центра. Метод применяют в различных вариантах, с использованием органических и неорганических носителей, включая ионообменные носители. Природа комплекса может существенно влиять на активность и операционную стабильность иммобилизованного фермента (табл. 3.4–3.5).



Сравнительно новой разновидностью металлохелатного метода является иммобилизация ферментов на основе гидроксидов переходных металлов, в основном титана и циркония. Молекулы фермента закрепляются на поверхности носителя путем образования хелатов. Для реализации данного метода, помимо фермента, необходимо наличие только одного реагента, собственно гидроксида металла.

Влияние метода иммобилизации с использованием комплекса TiCl4 на активность глюкозоамилазы (по Дж. Вудворду, 1988) Комплекс, использованный для активации Активность фермента, ед./г Операционная стабильность ферментов, иммобилизованных на носителях, активированных титаном (IV) (по Дж. Вудворду, 1988) Недостатком методов иммобилизации на основе физической адсорбции или ковалентного присоединения является необходимость использования достаточно больших количеств катализатора. Более того, химическая модификация, которой подвергаются ферменты в процессе иммобилизации. Может существенно снижать их каталитическую активность.

Избежать этого можно при использовании методов иммобилизации ферментов путем включения в полимерную структуру.

В качестве полимерных носителей применяют природные и синтетические материалы (альгинат, желатину, каррагинан, коллаген, хитин, целлюлозу, полиакриламид, фоточувствительные полимеры). Раствор фермента смешивают с раствором мономеров носителя. Далее создают условия для процесса полимеризации, в ходе которого происходит механическое включение фермента в структуру носителя. Важным моментом является равномерность распределения молекул фермента в объеме носителя и однородность получаемых агрегатов. Техника включения зависит от природы и свойств используемого материала, образуемые при этом биосистемы имеют вид гранул, волокон, полимерных сеток, пленок и т.п.

Иммобилизация в полиакриламидный гель (ПААГ), который наиболее часто используется для этих целей, заключается во внесении раствора фермента в раствор мономера (N, N1-метилендиакриламида). Далее в подобранных условиях быстро формируется гель в виде блока. Монолитный гель измельчают, придавая частицам форму кубиков желаемого размера.

При использовании желатины или агар-агара вначале подогревают их растворы, затем охлаждают и вносят фермент. В процессе последующего охлаждения происходит формирование геля. Полимеризация альгината происходит в присутствии некоторых катионов. Поэтому на первом этапе смешивают растворы фермента и мономеров этих полисахаридов, далее смесь с помощью дозирующего устройства вносят в раствор, содержащий ионы Ca2+ или Ba2+ (для альгината) или Al3+, Fe3+, K+ или Mo2+ (для каррагинана), при этом образуются сферические полимерные частицы в виде гранул.

Гели в зависимости от природы используемого полимерного материала отличаются по ряду показателей. Например, гели ПААГ недостаточно прочные, но этого можно избежать при использовании ПААГ, содержащего жесткую арматуру из керамики. При увеличении степени сшивки с целью придания большей прочности гелю возникают проблемы диффузионных затруднений. Альгинатные гели отличаются высокой прочностью и хорошими гидродинамическими свойствами, что не создает препятствий для притока к активным центрам молекул ферментов субстрата и оттоку образуемого продукта. При работе с альгинатом кальция важно отсутствие в иммобилизационной системе хелатирующих агентов (фосфатов, цитратов), которые, связывая кальций, разрушают структуру геля.

Привлекательной для использования является иммобилизация ферментов методом инкапсулирования. В этом методе главным является не создание физических или химических сил, необходимых для связывания катализатора с носителем, а удержание раствора, окружающего фермент. В процессе инкапсулирования иммобилизуются не отдельные молекулы фермента, а исходный раствор, содержащий фермент. При использовании метода иммобилизации применительно к ферментам чаще всего применяют коацервацию и межфазовую полимеризацию. Первый прием реализуется без химических реакций и включает фазовое разделение коллоидных частиц полимера, которые ассоциируют вокруг маленьких водных капель и образуют затем непрерывную мембрану. В качестве полимерных материалов при этом используют нитрат или ацетат целлюлозы, бутадиеновый каучук. При межфазовой полимеризации для образования полупроницаемой мембраны один из реагентов находится в водной, другой – в органической фазе; на границе раздела фаз происходит реакция полимеризации и вокруг диспергированных в органической фазе капель образуется слой полимера. С помощью этого метода могут быть получены мембраны из полиуретана или эпоксидных смол. Полупроницаемые мембраны, покрывающие раствор с ферментом, могут быть изготовлены из различных материалов (полистирола, полиакрилата, полиуретана, полиэфиров, липидов, поликарбонатов и т. д.). Варьируя материалы для получения полупроницаемой мембраны, можно осуществлять контроль размеров молекул. Например, большие по размерам молекулы ферментов удерживаются внутри капсулы, а более мелкие молекулы исходных субстратов и синтезируемых продуктов могут свободно диффундировать через мембрану.



Pages:     | 1 |   ...   | 20 | 21 || 23 | 24 |   ...   | 49 |
 



Похожие работы:

«Редакционный комментарий1 : ПРОФЕССОР ЕВГЕНИЙ МИХАЙЛОВИЧ МОРОЗОВ (к восьмидесятилетию со дня рождения) Механика разрушения в России берет свое начало от работ А.Ф. Иоффе по влиянию трещин на прочность твердых тел. Он установил, что после растворе ния в горячей воде слоя с поверхностными трещинами кристаллов каменной соли их прочность резко возрастала и приближалась к теоретической прочности. Явле ние увеличения прочности хрупких тел при удалении поверхностных трещин, за счет растворения в воде...»

«В. М. Головизнин, П. С. Кондратенко, Л. В. Матвеев, И. А. Короткин, И. Л. Драников АНОМАЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ РАДИОНУКЛИДОВ В СИЛЬНОНЕОДНОРОДНЫХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ФОРМАЦИЯХ НАУКА РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт проблем безопасного развития атомной энергетики В. М. Головизнин, П. С. Кондратенко, Л. В. Матвеев, И. А. Короткин, И. Л. Драников АНОМАЛЬНАЯ ДИФФУЗИЯ РАДИОНУКЛИДОВ В СИЛЬНОНЕОДНОРОДНЫХ ГЕОЛОГИЧЕСКИХ ФОРМАЦИЯХ Под редакцией члена-корреспондента РАН Л. А. Большова Москва Наука 2010 УДК 621.039 ББК...»

«Лотос-Пресса Санта Фе, Нью-Мехико ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5 ПРЕДИСЛОВИЕ 8 ГЕРБОЛОГИЯ: ВОСТОК И ЗАПАД 13 ПРОЯВЛЕНИЯ СОЗНАНИЯ В РАСТЕНИЯХ 16 ИСТОКИ АЮРВЕДСКОЙ МЕДИЦИНЫ 22 Духовные истоки 22 Три гуны 23 Пять элементов 25 Три доши 26 Семь тхату и оджас 37 Пять пран 40 Системы организма (сротас) 42 Агни и растения 44 ЭНЕРГЕТИКА ТРАВ 46 Вкус (раса) 46 Энергия (вирья) 49 Випака. Пост-пищеварительный эффект 52 Прабхава. Особая сила воздействия 54 Описание шести вкусовых...»

«1 И.Н.Бекман ЯДЕРНАЯ ИНДУСТРИЯ Курс лекций Лекция 9. ИСТОЧНИКИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ Содержание. 1. КЛАССИФИКАЦИЯ ИСТОЧНИКОВ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 2 2. ПРИРОДНЫЕ ИСТОЧНИКИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 2 3. ТЕХНОГЕННЫЕ ИСТОЧНИКИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ 3 3.1 Радионуклиды – источники ионизирующих излучений 5 3.2 Источники -частиц, протонов и атомов отдачи продуктов деления. 9 3.3 Источники электронов 9 3.3.1 Изотопные источники электронов 9 3.3.2 Ускорители электронов 10 3.4 Источники...»

«Н. В. КОРОВИН ОБЩАЯ ХИМИЯ Рекомендовано Министерством образования и науки Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по техническим направлениям 14-е издание, переработанное УДК 54(075.8) ББК 24.1я73 К681 Победитель Всероссийского конкурса учебников нового поколения по общим фундаментальным естественно-научным дисциплинам Р е ц е н з е н т ы: кафедра химии Научно-учебного комплекса Фундаментальные науки Московского государственного технического...»

«1 Школьные конкурсные проекты предлагают простые энергетические решения для сохранения климата Всероссийский конкурс SPARE 2011-2012 учебного года в рамках шестого международного конкурса школьных проектов по энергоэффективности Энергия и среда обитания проводился под лозунгом Сохраним климат с помощью простых энергетических решений. Цель конкурса: внедрение идей и методов энергосбережения в обществе, создание у школьников мотивации для сбережения ресурсов и энергии. Конкурс поддерживается...»

«Санкт-Петербург 2005 ЕВРОПЕЙСКАЯ ПРАКТИКА ОБРАЩЕНИЯ С ОТХОДАМИ: ПРОБЛЕМЫ, РЕШЕНИЯ, ПЕРСПЕКТИВЫ Санкт-Петербург 1 2005 В книге раскрыты нормативно-правовые основы деятельности стран Европейского Союза в сфере охраны окружающей среды, предложены основные виды классификации отходов и схемы обращения с ними в ЕС; представлены примеры практических действий по повышению эффективности систем управления отходами в странах Европы и взгляд на перспективы развития. Материал предназначен для сотрудников...»

«А.Е. Алоян ДИНАМИКА И КИНЕТИКА ГАЗОВЫХ ПРИМЕСЕЙ И АЭРОЗОЛЕЙ В АТМОСФЕРЕ Курс лекций Москва 2002 УДК 519.21 Издано при финансовой поддержке ББК 22.16 Российской академии наук A51 по программе целевых расходов Президиума РАН Алоян А.Е. Динамика и кинетика газовых примесей и аэрозолей в атмосфере / Курс лекций. – М.: ИВМ РАН, 2002. – 201 с. – ISBN 5-901854-05-5 Изложен курс лекций по математическому моделированию динамики и кинетики малых газовых примесей и аэрозолей в атмосфере, читаемый автором...»

«Перевод с английского С. Поповича Тайберонн Джеймс Т12 Говорит Метатрон: Беседы с Архангелом / Перев. с англ. — М.: ООО Издательство София, 2010. — 288 с. ISBN 978-5-399-00131-9 Путешественник, геолог, музыкант, мистик и ченнелер, восходящая звезда современной метафизики Джеймс Тайберонн собрал в этой книге самые интересные и актуальные послания от Архангела Метатрона. Здесь обсуждаются такие темы, как планетарные энергетические решетки, лей-линии, места силы, целительные камни, сакральная...»

«Главные темы № 20: 1. Наука о климате и современная климатическая дискуссия в обществе – интервью с заместителем директора Института глобального климата и экологии Росгидромета и РАН, членом бюро Межправительственной группы экспертов по изменению климата (МГЭИК), профессором С.М.Семеновым 2. Оценки последствий изменения климата для сельского хозяйства стран ЕС (проект Peseta) и России – комментарий ведущего научного сотрудника Всероссийского научноисследовательского института...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.