«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

- мезенхимальные стволовые клетки - мультипотентные региональные стволовые клетки, содержащиеся во всех мезенхимальных тканях (главным образом в костном мозге), способные к дифференцировке в различные типы мезенхимальных тканей, а так же в клетки других зародышевых слоев (рис.9);

- стрюмальные стволовые клетки - мультипотентные стволовые клетки взрослого организма, образующие строму костного мозга (поддерживающую гемопоэз), имеющие мезенхимальное происхождение.

- тканеспецифичные стволовые клетки - располагаются в различных видах тканей и в первую очередь, отвечают за обновление их клеточной популяции, первыми активируются при повреждении. Обнаружены тканеспецифичные стволовые клетки кожи и скелетной мускулатуры, нервной системы, миокарда, эпителиальные стволовые клетки пищеварительного тракта, мезенхимальной ткани (костной остеоциты, хрящевой - хондроциты, жировой - адипоциты), а также к другим типам клеток соединительной ткани.

Рис.9. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), выделенные из жировой ткани человека (http:// www.stemcellr) ЭСК характеризуются своей способностью неограниченно раз­ множаться в культуре, сохраняя нормальный кариотип и недиф ­ ф ерен ц и рован н ое состоян и е. Они обладаю т п отенциалом дифференциации в лю бой специализированны й тип клеток тела.

Знание транскрипционного профиля, связанного с плю рипотентностью и ранним развитием, необходимо для лучшего понимания их потенциала развития и поддержания недиф ференцированного состояния (рис. 10.).

Эмбриональные стволовы е клетки определяю тся тремя основ­ ными характеристиками:

- во-первых, это неспециализированны е клетки (в отличие от клеток, из которых состоят мышцы, мозг и т.д.);

2.2. Стволовые клетки, технологии получения и применения - во-вторы х, ЭСК способны делиться в течение долгого вре­ идентичны е клетки;

- третье важ ное свойство ЭС К то, что они способны к ди ф ­ ф еренциации в специф ические типы клеток. Они могут ди ф ф е­ ренцироваться в три различных типа тканей: эндодерму, дающую начало внутренним органам; м езодерм у (соединительная ткань, мышцы, систем у кровообращ ения и костная ткань) и эктодерму (кожа, органы чувств и нервные клетки).

после оплодотворения разования, состоящего из мультипотеитную (специали­ «всемогущие») клетки. бластоцисты впоследствии стадию развития (например, П р и м е ч а н и е. Э м бриональны е стволовы е клетки (первые 6 дней развития бластоцисты) дифференцируются в клетки экзодермы, мезодермы, эндодермы (всего около 350 типов клеток, которые образуют органы и ткани человеческого организма), (http || moikom pas.ru | img | compass)

2. КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ

Получение стволовых клеток Эмбриональные стволовые клетки можно получать при про­ цедуре искусственного оплодотворения; клиники, практикующие экстракорпоральное оплодотворение, во время процедуры in vitro обычно используют более одной оплодотворенной яйцеклетки, так как часто первая имплантация может оказаться безуспешной, и требуется еще несколько повторов. В результате остаются тысячи невостребованных яйцеклеток, которые можно исполь­ зовать для получения стволовых клеток. Также можно исполь­ зовать эмбрионы, полученные клонированием in vitro.

Гемопоэтические стволовые клетки в основном получают из пуповинной крови. Кровь из пуповины, несколько десятков м иллилитров которой вы ливается при рож дении ребенка, содержит немало стволовых клеток, в основном ГСК. Общая концентрация ГСК в пуповинной крови ниже, но число ранних клеток-предшественников значительно выше, чем в костном мозге (например, в пуповинной крови содержится в 2 раза больше полипотентных ГСК, чем в таком же объеме трансплантанта костного мозга). Но главное, пуповинную кровь не надо специально забирать с помощью особого оборудования. Достаточно вовремя собрать ее после родов в стерильный пластиковый контейнер, затем провести анализ образца, заморозить с помощью жидкого азота и поместить на хранение. За 1 раз может быть собрано в среднем около 80-100 мл пуповинной крови. В среднем, для трансплантации достаточно 1 мл пуповинной крови на 1 кг массы тела реципиента. Количество стволовых клеток в пуповинной крови не достаточно велико, и эффективное их использование возможно только однократно для самого ребёнка до Юлет.

Условия культивирования стволовых клеток Для культивирования стволовых клеток используются питатель­ ные среды, содержащие все соединения, необходимые для роста и выживания. Основа сред - минеральные компоненты, подобран­ ные по составу и концентрации для сохранения кислотнощелочного баланса и осмотического градиента. Обязательно нали­ чие аминокислот, витаминов, гормональных и иных биологически активных соединений. Культивирование стволовых клеток требует 2.2. Стволовые клетки, технологии получения и применения соблюдения строго определенной температуры, соотношения углекислого газа/кислорода, абсолютную стерильность, строго периодическую замену питательной среды, ежедневный микроскопический контроль и, главное, своевременный пересев, дорогостоящие ростовые факторы и фетальную сыворотку. Белки сыворотки содержат различные, как стимулирующие, так и тор­ мозящие факторы роста. Обязательны своевременные пересевы, иначе клетки во флаконах становятся на путь необратимой дифференцировки в различные типы клеток (сердечной мышцы, костной ткани, жировые клетки, хрящевой ткани и т.д.) Биоматериалы (костный мозг, кожа, пуповинная кровь) обязательно тестируются на наличие возбудителей инфекционных заболеваний методами ИФА, ПЦР.

Технология получения концентрата ГСК пуповинной крови Забор пуповинной крови производится в стерильные емкости (шприцы или полиэтиленовые пакеты), содержащие изотоничес­ кий антикоагулянт, с соблюдением мер асептики и предосторож­ ностей, исключающих инфицирование материала в процессе забора. Транспортировка материала осуществляется при комнат­ ной температуре в изотермическом транспортном контейнере.

В процессе выделения стволовых клеток пуповинная кровь под­ вергается поэтапной обработке, в результате чего происходит освобождение от избытка плазмы, практически всех форменных элементов красной крови и большинства зрелых лейкоцитов.

Данный способ получения концентрата гемопоэтических ство­ ловых клеток является дорогим, но наиболее эффективным. При­ меняются различные методы сепарации стволовых клеток (получе­ ния концентрата), в том числе центрифугирование на градиенте плотности фиколла и седиментации гидроксиэтил крахмал ом.

Для последующего криогенного хранения концентраты стволовых клеток в аутологичной плазме расфасовываются в криопробирки и замораживаются в присутствии 10% ДМСО до температуры -90 градусов Цельсия с последующим хранением в жидком азоте. Ж изнеспособность клеток после пробного размораживания (валидации) составляет не менее 80%.

2. КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ

Выделение и культивирование мезенхимальных СК человека Для выделения мезенхимальных СК используются образцы костного мозга и жировой ткани человека с последующим культи­ вированием их на специальных средах, содержащих сыворотку крови животных (в возможных случаях используется аутологичная сыворотка пуповинной крови) для получения «терапевтической дозы» клеток. Интервалы между пассажами составляют в среднем 7-9 суток, и для получения 100 млн. МСК требуется около 6 недель.

На протяжении последующих 2-3 недель клеточная масса может быть увеличена еще в 100 раз. При соблюдении существующих треб ован и й, предъ являем ы х к продуктам крови, и условий асептического производства возможно создание технологии эффективного культивирования клеток человека, пригодных для клинического использования. Одной из причин, ограничивающих клиническое применение аллогенных МСК, является необходи­ мость размножения их в культуре. А следствием присутствия в составе сред для культивирования клеток высоких концентраций сыворотки крови животных (эмбриональной телячьей, лошадиной и другой сы воротки) м ож ет являться риск инфицирования пациента агентами прионной природы или зоонозными инфек­ циями, даже, несмотря на то, что сыворотки от ведущих произ­ водителей тщательно тестируются. Другая опасность заключается в возможности иммунизации пациента ксеногенными белками, что особо опасно при повторном введении клеточного материала. И то и другое диктует необходимость поиска альтернативных путей культивирования МСК человека.

Применение стволовых клеток Трансплантация стволовых клеток прочно вошла в современные методы лечения целого ряда наследственных и приобретенных заболеваний. ГСК уже на протяжении десятилетий используются для восстановления кроветворения у больных с онкологическими и гематологическими заболеваниями.

Разрабатываются технологии применения МСК при лечении инфаркта миокарда и хронической сердечной недостаточности.

Сотрудники больницы Университета Осаки в декабре 2007 года сообщ или об успеш ном заверш ении клеточной терапии 2.2. Стволовые клетки, т ехнологии получения и применения сократительной способности м иокарда после перенесенн ого скелетной м ы ш цы п ац и ен та. Р езультат оказался д остаточн о ш ейся п ересадки сердца. К л ето ч н ая тер ап и я п о сл е перен есен н ого инф аркта д ал а д о лго вр ем ен н ы й эф ф ект. Т акж е успеш но п ровед ены кл и н и ч ески е и сп ы тан и я сп о со б а клето чн о й тер ап и и инф аркта м и окарда с пом ощ ью внутри ко р о н ар н о й инф узии к он ц ен трата С К терап и и при л ечени и заболеван ий, которы е до п оследнего врем ени Успешно применена технология клеточной терапии путем пересадки нейробластов, полученных из ЭСК тератокарциномы NTERA-2 человека. Незрелые клетки размножались пассажами для получения биомассы в количестве 50-100 млн. клеток.

Часть клеток использовалась для характеристики фенотипа и процента примесей, на отсутствие контаминации вирусами и бактериями. Далее из среды убирали LIF и фидерный слой стромальных фетальных клеток, создавая условия для направленной дифференцировки ЭСК в нейроны (фидерный слой необходим для размножения ЭСК, он же препятствует процессу их дифференциации). Далее культуру нейробластов пропускали через поточный сортировщик клеток, чтобы полностью удалить клетки тератокарциномы. После тщательной подготовки, вторичной очистки и характеристики фенотипа клеток для трансплантации с помощью специальной микроканюли и шприца под контролем стереотаксиса и компьютерной томографии 10-12 млн. нейробластов вводили в базальное ядро мозга пациента через 6 месяцев после геморрагического инсульта. 12-месячное наблюдение после трансплантации нейронов в зону инсульта не выявило побочных эффектов. У половины пациентов развивались достоверные улучшения моторной симптоматики в период 6-12 месяцев после пересадки. Положительные клинические симптомы отмечались с параллельным улучшением кровоснабжения зоны инсульта после трансплантации клеток.

В недряю тся технологии им п лан тации аутологи чн ы х ф ибробластов с целью стим уляц ии роста собствен н ой коллаген овой клеток в области старею щ ей, дряблой, иссуш онной кож и, в области появления м орщ ин и др.

Способы введения стволовых клеток В веден ие стволовы х клеток в орган и зм р ец и п и ен та п р о и з­ водится в стерильны х условиях проф ессионально подготовленны м венно, внутрим ы ш ечн о, подкож но или в виде апп ли каци й).

2. КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ