«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

генетическая конструкция ген пролиндегидрогеназы в геноме растения в присутствии антисмысловых РНК - в отсутствие антисмыслоеых РНК прекращение трансляции, разрушение нормальный синтез фермента мРНК пролиндегидрогеназы и прекращение синтеза фермента Рис.5. Синтез антисмысловых РНК ингибирует экспрессию гена-мишени на постгранскрипционном уровне (антисенс ингибирование фермента пролиндегидрогеназы), (Э.Файер и К М элоу, 2007) 1.2. ДНК - диагностика И дентифицированы гены наследственной предрасполож ен­ ности к некоторым распространенным формам рака, на молеку­ лярном уровне диагностируются «больные» гены, чья связь с раком молочной железы, яичников, толстой кишки, щитовидной железы, детскими эмбриональными опухолями сетчатки глаза (ретинобластом а) и почки (неф робластом а) четко доказана.

Н априм ер, и дентиф ицированы гены, которы е инициирую т 1.2. Д Н К - диагност ика процесс канцерогенеза в клетках молочной железы и яичников BRCA1, BRCA2, ген «Ret». Появление мутации в этих генах может привести к развитию злокачественной опухоли также в толстой кишке, в предстательной и щитовидной железах. Поэтому такие пациенты обязательно должны пройти детальное обследование.

Двадцатилетний студент ни на что не жалуется. Но его бабушка и тетя умерли от рака щитовидной железы, не дожив до тридцати лет. Да и мама перенесла несколько операций. Наученная горьким опытом и будучи женщиной весьма образованной, она настояла на том, чтобы молодого человека всесторонне обследовали. Выяснилось, хлопотала не зря: у него обнаружили ту же мутацию! По мнению генетиков, с операцией медлить в прямом смысле слова смерти подобно. Хирурги отнюдь не сразу согласились с точкой зрения генетиков. В самом деле, как можно лишать человека здоровой щитовидной железы, если клинические проявления болезни отсутствуют!? Какой хирург на это пойдет? Однако генетики настояли на своем.

После операции гистология подтвердила наличие злокачественных клеток в удаленной железе.Но ведь ни УЗИ, ни биопсия, ни другие тонкие исследования ровным счетом ничего не показали. Мутация была связана с геном «Ret».

В настоящее время ДНК-диагностика в определенной мере вытеснила традиционные цитологические подходы и используется на всех этапах онкологического обследования - при профилак­ тике, диагностике и лечении онкологических больных. Для ДНКдиагностики опухолевых синдромов необходимо проведение полного секвенирования нуклеотидной последовательности нескольких генов. Пока проведение такого исследования стоит очень дорого. Однако в некоторых случаях существуют более экономичные подходы. К примеру, повышенный риск развития рака молочной железы вызывают дефекты в генах BRCA1 и BRCA2. Очень часто они располагаются в одних и тех же участках гена и для выявления таких мутаций полномасштабного секвени­ рования не требуется. Микросателлитная нестабильность при повреждениях генов наследственного неполипозного рака толстой кишки (MSH2, MLH1) также выявляется при помощи относительно простого теста. При этом существенна роль родословного анализа.

Наследственный множественный аденоматозный полип толстой кишки идентифицируется обнаружением его маркерных белков, что значительно проще секвенирования.При молекулярной диагностике некоторых онкозаболеваний очень важны тесты на клональность. Смысл тестов на клональность состоит в том, что клетки опухоли берут начало из единого источника, поэтому для н и х х арактерн а практически идентичная генетическая характе­ ристика. Например, тест на клональность составляет основу диаг­ н остики лимфом. При идентификации же истинного билатераль­ ного рака молочной железы используется другой метод - аллелоти п и рован и е парных образцов ДНК и т.д.

М ногие ДНК-тесты уже отнесены к ряду рутинных процедур.

И м енно так можно сказать о методе полимеразной цепной ракции (р и с.6), который позволяет реплицировать нуклеиновые кислоты в н е о гр ан и ч ен н ы х количествах. Для репликации ДНК ПЦРм етодом используются ферменты ДНК-полимеразы, т.е. те самые ф ерм енты, которые в клетках синтезируют из отдельных нуклео­ ти дов комплементарные цепочки ДНК. С этой целью в пробирку с Д Н К вносят смесь активированных мононуклеотидов, фермент Рис. б. М етод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет в неограниченном количестве «размножать» нуклеиновые кислоты, п р о и зв ёл настоящ ую революцию в биологии. Суть метода проста: спираль ДНК разд ел я ю т нагреванием, а затем на каждой цепи с помощью специального ф е р м е н та со би р аю т цепочку, комплементарную исходной. В результате из одной двуцепочечной Д Н К получается две. Из двух - четыре и т. д.

ДНК-полимеразу и праймеры - это олигонуклеотиды, комплемен­ тарные концам реплицируемой ДНК. При нагревании цепи ДНК расходятся. Затем, при охлаждении, с ними связываются прай­ меры, образуя короткие фрагменты спиральных структур. Фер­ мент присоединяет к праймерам нуклеотиды и собирает цепочку, комплементарную исходной цепочке реплицируемой ДНК.

В последующем цикл многократно повторяется.

Столь же перспективны для применения в онкологии ПЦР в режиме реального времени, капиллярный электрофорез нуклеино­ вых кислот, масс-спектрометрия.

1.3. Принципы генной терапии Разработке программы генной терапии предшествуют тщатель­ ный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распреде­ ления его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола. Апроба­ цию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально активен данный ген. На этих клеточных моделях оценивают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводимой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне.

Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому особое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных моделях соответствующих наслед­ ственных болезней у животных. Успешная коррекция генетичес­ ких дефектов у таких животных и отсутствие нежелательных побочных эффектов генной терапии являются важнейшей пред­ посылкой для разрешения клинических испытаний.

Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследст­ венного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается с создания полноценно работающей (экспрессирую­ щ е й с я ) ген ети ч еской конструкции, содержащей смысловую (кодирующ ую белок) и регуляторную части гена. На следующем э т а п е р еш ается проблема вектора, обеспечивающего эффек­ тивную, а по возможности и адресную доставку гена в клетким и ш ен и. Затем проводится трансфекция (перенос полученной к о н с тр у к ц и и ) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансф екции, степень коррегируемости первичного биохимичес­ кого дефекта в условиях клеточных культур in vitro и, что особенно важ но, in vivo на животных - биологических моделях. Только п о с л е эт о го м ож но приступать к программе клинических испы таний (табл.1).

Таблица 1. Генотерапия различных заболеваний Моногенные наследственные Онкологические заболевания Инфекционные заболевания Сосудистые заболевания 1.4. Генная терапия онкозаболеваний Несмотря на то, что круг ненаследственных заболеваний, где возмож но применение генной терапии, очень широк, до 80% всех с о в р е м е н н ы х прот околов лечения терапевтическими генами приходит ся на опухолевы е заболевания (табл 2). Генная терапия о н к оза б о леваний направлена на:

- у с и л е н и е иммуногенности опухоли;

Т а б л и ц а 2. Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний Повышение иммунореактивности опу­ Гены чужеродных антигенов, ци­ Генетическая модификация иммунных Гены цитокинов, ко-стимуляторов клеток Инсерция генов "чувствительности" ли­ Гены тимидинкиназы HSV, цитобо генов - "самоубийц" зин- дезаминазы Защита нормальных клеток от химиоте­ Гены лекарственной устойчивости Индукция синтеза противоопухолевых Гены интерлейкина-2, интерферо­ Продукция противоопухолевых реком­ Вакцины типа БЦЖ, экспресси­ Локальная радиопротекция нормальных Гены трансферазы, глутатион синтканей с помощью антиоксидантов тетазы Примечание. Потеря функциональной активности р53 (р53 - белок, одна из главных функций которого - защищать клетку от любых неблагоприятных воздействий) значительно увеличивает темп появления размножающихся клеток с самыми разными генетическими аномалиями - измененным числом и перестройками хромосом, генными мутациями, амплификацией отдельных участков генома, (с сайта:

medi.ru/pbmc/8800306.htm).

В эксперим енте разработана антианги оген нная терапия, нап рав­ ткани. Неоангиогенез - это формирование сети новых капилляров из э н д о т е л и а л ь н ы х к л е т о к, в ы с ти л а ю щ и х м е л к и е в ен у л ы необходимое условие для дальнейшего роста опухолевого узелка, достигш его 1-2 мм в диаметре. Ангиогенная активность опухоли обусловлена сложным балансом между ангиогенными стимулами и природны ми ингибиторам и ангиогенеза. В опухолях опреде­ ляется повышенный уровень стимуляторов ангиогенеза, тогда как уровень эндогенных ингибиторов ангиогенеза снижен. Введение ингибиторов ангиогенеза (природных или синтетических) в экс­ периментах in vivo приводило к остановке роста опухоли и их регрессии. Эти достижения позволили создать новую стратегию лечения злокачественны х новообразований - антиангиогенную терапию, оказывающую цитостатический эффект на опухолевую ткань.

У силение противоопухолевой активности клеток иммунной систем ы путем трансф екции в Т -лим ф оциты пациента генов, кодирующих фактор некроза опухолей или устойчивость к неомицину или синтез вариабельных участков моноклональных антител, усиливающих рецепцию и действие этих лимфоцитов на опухо­ левые клетки.

Также существуют способы специфической (активная — введе­ ние аутологичны х антигенпрезентирую щ их клеток, прединкубированны х in vitro с опухолевы м и антигенам и; пассивная введение пациенту противоопухолевых моноклональных антител) (рекомбинантные ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-14, TNF-альфа и др.; интерферонотерапия, иммуномодуляторы — чаще все в качестве адъю­ вантной иммунотерапии, для профилактики в послеоперационном периоде метастазирования).

Возможна внутриклеточная иммунизация —это восстановление нормального фенотипа клеток при помощи введения антисмысловых РНК или антител к онкобелкам. Разработан метод направ­ ленного убийства опухолевых клеток, заключающийся во введе­ ние генов, специф ически экспрессирую щ ихся в опухолевы х клетках и продуцирующих токсин, например дифтерийный или введение генов, подавляющих гены-супрессоры белка р53 и др.

Терапия, инициирующая апоптоз опухолевых клеток, путем введения проапоптических генов. Усиление иммуногенности опухолевых клеток, использование противоопухолевых вакцин.

В качестве противоопухолевых вакцин применяются:

а) иммунизация синтетическими пептидами, аналогичными опухолевым антигенам;

б) источником опухолевых антигенов служат сами инактивиро­ ванные клетки, которые для преодоления толерантности генети­ чески модифицируются с тем, чтобы они могли вызвать продук­ цию антиопухолевых цитокинов (интерлейкинов, интерферонов);

в) на основе дендритных клеток (это антигенпрезентирующие клетки) пациента, нагруженных (ex vivo) опухолевыми антигенами в виде пептидов или клеточных лизатов;