«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»
- следующий механизм, приводящий к устойчивости бактерий к антибиотикам связан с активным выведением их из микробной клетки, так называемый механизм «помпы» («помпы» - это белки, связывающие и выводящие ксенобиотики, в том числе антибио тики из клетки; это белки, транспортирующие ксенобиотики в периплазматическое пространство; это белки, образующие поры, каналы для вы ведения антибиотиков; и это белки-линкеры, расположенные в периплазматическом пространстве и связы вающие белки-транспортеры с белками-каналообразователями).
Одна и та же «помпа» (например, у P.aeruginosa) может удалять из клетки несколько совершенно различных, как по структуре, так и механизму действия препаратов антибиотического действия;
Механизм устойчивости к тетрациклинам обусловлен процессом активного выведения. Д етерминанты резистентности обычно локализованы на плазмидах, что обеспечивает быстрое внутрии межвидовое распространение устойчивости к этим антибио тикам.
- м одиф икация миш ени м икробной клетки, на которую действует антибиотик. Например, хинолоны и фторхинолоны опосредуют свое антимикробное действие через бактериальные ферменты - ДНК-гиразу и топизомеразу IV. Инактивация этих ф ерм ен тов, этих миш еней в м икробной клетке приводит к нарушению репликации бактериальной ДНК. Спонтанные мутации сопровождаются активацией генов, кодирующих метилирование 23S либо 50S - субъединицы рибосомальной РНК микроорганиз мов. Поэтому антибиотики теряю т способность связываться с рибосомой и нарушать синтез белков-ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV. Основным механизмом устойчивости к аминогликозидам является их ферментативная модификация микроорга низмами. Модифицированные молекулы аминогликозидов теряют способность связываться с рибосомами и подавлять биосинтез белка в микробной клетке. Ведущим механизмом устойчивости к фторхинолонам является модификация мишеней - двух бакте риальных ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, опосре дующих конформационные изменения в молекуле бактериальной ДНК, необходимые для ее нормальной репликации. Модификация мишени действия макролидов, кетолидов и линкозамидов является 50S субъединица бактериальной рибосомы.
Ф орм ирован ие м етаб о л и ч еско го «ш унта», ещ е один из механизмов антибиотикоустойчивости.
8.5. Микробиологический синтез антибиотиков 8.5. Микробиологический синтез антибиотиков Микробиологический синтез начинается с подготовки среды культивирования. С убстрат должен давать хорош ий рост и разм нож ение м икроорганизм ов, долж ен быть доступным и дешевым. Питательная среда стерилизуется предварительно в цехе изготовления либо непосредственно в биореакторе влажным паром под давлением. Одновременно идет подготовка посевного материала, чистая культура штамма-продуцента наращивается в последовательно возрастающем объеме (1-10-100 и более литров).
Следующий этап - это аэробная, глубинная, периодическая фер ментация в течение нескольких суток; это зависит от вида микроорганизмов-продуцентов, объема биореактора и др. В процессе ферментации поддерживается оптимальная температура, pH, р 0 2, условия постоянного перемешивания и аэрации (если используется аэробная культура микроорганизма-продуцента) и пеногашения с использованием химических и физических способов.
Так как антибиотические вещества являются вторичными метаболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры продуцента в идиофазу. Следовательно, целесообразно лимитиро вание роста продуцента в этой фазе. Таким лимитирующим фактором при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза, тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами - фосфаты.
Все это важно при составлении рецептур питательных сред для штамма — продуцента в процессе биосинтеза антибиотика.Так, среда для продукции пенициллина включает глюкозу - 1,5%, лактозу - 5% (лактоза снимает катаболитную репрессию глюкозы), аммония сульфат и фосфаты - 0,5-1%, кукурузный экстракт - 2предшественники антибиотика - фенокси- или фенилуксусная кислота —0,3-0,6%, мел - 0,5-1%, пеногаситель —0,5-1%; темпе ратуру ферментации поддерживают на уровне 22-26°С при pH от 5,0 до 7,5 и'аэрации 1 м3 воздуха на 1 м3 среды в 1 минуту;
продолжительность ферментации - 4 суток.
Так называемая «всеядность» актиномицетов обеспечивает им способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содержащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пшеницы и пр.), крахмал.
Тем не менее, применительно к каждому продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в регламентной докумен тации. Например, посевной материал Streptomyces kanamyceticus получают на соево-крахмальной среде и на ней же проводят основную ферментацию при 27-28°С в течение 4-5 суток при поддержании pH на уровне 7,1-7,6. При ферментации Str. floridae (продуцент виомицина, или флоримицина) рекомендуют среду, содержащ ую глюкозу или гидрол, соевую муку, кукурузный экстракт, нитраты, мел; температуру поддерживают в пределах 27-29°С, pH на уровне 7,0-7,3. В случае ферментации Str. erythreus в питательную среду добавляют пропиловый спирт, как предшест венник антибиотика эритромицина. Продуцент нистатина Str.
nourasei интенсивно потребляет аммонийный азот (не нитратный) и т.д.
Н апример, при культивировании Penicillium chrysogenum лактоза используется микроорганизмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 ч развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150-160 ч и это спо собствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и вы сокий уровень биосинтеза пенициллина, рентабельность производства антибиотика.
Для биосинтеза хлортетрациклина культурой Str. aureofaciens лучшим источником углерода в среде является глюкоза. Однако увеличение содержания глюкозы в среде выше 3% при неизменной концентрации других ком понентов зам етно сниж ает выход антибиотика.
Макро- и микроэлементы также существенны в биопродуцирую щей активности микроорганизмов. Многие из них входят в состав протоплазмы микробной клетки в качестве составных частей некоторых ферментов, другие элементы выступают в качестве 8.5. Микробиологический синтез антибиотиков компонентов, регулирующих осмотическое давление или изме няющих гидрофильность протоплазмы клеток. Недостаток фосфора в среде приводит к резкому изменению у актиномицетов обмена веществ, связанного с нарушением потребления и усвоения углеводов и азота. В свою очередь избыток фосфора в среде также резко влияет на метаболизм организмов. Так, продуцент стрептоми цина Streptomyces griseus весьма чутко реагирует на изменение концентрации фосфора в среде; при его повышении происходит резкое снижение выхода антибиотика. Аналогичные закономер ности наблюдаются у продуцентов антибиотиков тетрациклиновой природы (Streptomyces aureofaciens, Str. rimosus), у продуцента аурантина {Str. auranticus) и других микроорганизмов. Изменение концентрации серы в среде приводит к изменению физиологи ческого состояния мицелия P.chrysogenum и уровня биосинтеза пенициллина. Причем сера выступает в качестве своебразного конкурента фосфора при воздействии их на мицелий гриба. При повышении концентрации фосфора наблюдается развитие не продуцирующего антибиотик мицелия гриба I-III возрастных фаз.
Увеличение же концентрации серы, наоборот, способствует тому, что наибольшее количество биомассы гриба составляет продук тивный мицелий 1V-VI возрастных фаз.
Многие бактерии, продуцирующие антибиотики, размножаются лучше при нейтральной среде (pH 7,0). Хотя молочнокислые стрептококки, синтезирующие низин, размножаются в среде при pH равном 5,5-6,0. Большинство актиномицетов —антагонистов хорошо развивается в тех случаях, когда начальное значение pH среды находится в пределах от 6,7 до 7,8. В подавляющем боль шинстве случаев актиномицеты не размножаются при pH ниже 4,5-4,0.
Для большинства бактерий температурный оптимум лежит в пределах 30-37°С. Для Bacillus subtilis - продуцента грамицидина С - оптимальной температурой является 40 градусов Цельсия.
Хотя этот же микроорганизм может нормально размножаться и синтезировать антибиотик и при при температуре 28 градусов Цельсия, но при этом максимум накопления грамицидина в куль туральной среде запаздывает примерно на 24 часа. Актиномицеты продуценты антибиотиков, как правило, культивируются при температуре 26-30°С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут размножаться как при пониженных температурах (от 0 до 18°С), так и при повышенных (55-60°С). Для большинства мицелиальных грибов оптимальной признана температура 25-28°С.
Усилить синтез антибиотиков можно внося в культуральную среду метаболиты- предшественники. Для бензилпенициллина это фенилуксусная кислота, для макролидных антибиотиков пропионовая ки слота и пропиловы й спирт, для пептидного антибиотика грамицидина-S 1 L-фенилаланин и т.д.
Иногда применяется двухфазная ферментация: в начале быстро наращ ивается биом асса культуры на деш евом и доступном субстрате, а затем в среду культивирования вносятся метаболитып ред ш ественни ки, и зб ирательно усиливаю щ ие продукцию искомого антибиотика. Предшественники вносятся в фермента ционную среду в конце экспоненциальной фазы развития культуры микроорганизма (при периодической ферментации), потому что биосинтез антибиотиков возрастает в фазе замедленного роста (конец трофофазы) и достигает максимума в стационарной фазе, в идиофазе.
Затем проводится обработка ферментационной биомассы:
фильтрация, если антибиотик накапливается в культуральной жидкости; если антибиотик накапливается внутриклеточно, то проводится осаждение клеток, их разрушение с целью выделения антибиотика. Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В этих случаях, как правило, используют фильтрацию.
Качество твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации. Существует следующая закономерность - нативная бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом того факта, что высшие актиномицеты способны формировать нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит несколько легче, чем других бактерий.
Определенные трудности выделения антибиотиков из культу ральной среды обусловлены ее многокомпонентностью и малой концентрацией в них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться примерно до 30 г/л при 8%-м выходе из субстрата.
При этом сухие вещ ества после отделения мицелия обычно 8.5. Микробиологический синтез антибиотиков составляют порядка 3-6%, из которых лишь 15 - 30% являются антибиотическими соединениями. Поэтому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так, чтобы антибиотическое вещ ество переходило в ту фазу, из которой затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщелачиванием культуральной среды (новобиоцин), добавлением солей, щавеле вой кислоты (эритромицин) и т.д.
С целью выделения антибиотиков, их концентрирования на различных стадиях технологического процесса используются методы экстракции, ионообменной сорбции, хроматографические методы (тонкослойн ая хром атограф ия), осаж дения и др.