«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

- следующий механизм, приводящий к устойчивости бактерий к антибиотикам связан с активным выведением их из микробной клетки, так называемый механизм «помпы» («помпы» - это белки, связывающие и выводящие ксенобиотики, в том числе антибио­ тики из клетки; это белки, транспортирующие ксенобиотики в периплазматическое пространство; это белки, образующие поры, каналы для вы ведения антибиотиков; и это белки-линкеры, расположенные в периплазматическом пространстве и связы ­ вающие белки-транспортеры с белками-каналообразователями).

Одна и та же «помпа» (например, у P.aeruginosa) может удалять из клетки несколько совершенно различных, как по структуре, так и механизму действия препаратов антибиотического действия;

Механизм устойчивости к тетрациклинам обусловлен процессом активного выведения. Д етерминанты резистентности обычно локализованы на плазмидах, что обеспечивает быстрое внутрии межвидовое распространение устойчивости к этим антибио­ тикам.

- м одиф икация миш ени м икробной клетки, на которую действует антибиотик. Например, хинолоны и фторхинолоны опосредуют свое антимикробное действие через бактериальные ферменты - ДНК-гиразу и топизомеразу IV. Инактивация этих ф ерм ен тов, этих миш еней в м икробной клетке приводит к нарушению репликации бактериальной ДНК. Спонтанные мутации сопровождаются активацией генов, кодирующих метилирование 23S либо 50S - субъединицы рибосомальной РНК микроорганиз­ мов. Поэтому антибиотики теряю т способность связываться с рибосомой и нарушать синтез белков-ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV. Основным механизмом устойчивости к аминогликозидам является их ферментативная модификация микроорга­ низмами. Модифицированные молекулы аминогликозидов теряют способность связываться с рибосомами и подавлять биосинтез белка в микробной клетке. Ведущим механизмом устойчивости к фторхинолонам является модификация мишеней - двух бакте­ риальных ферментов ДНК-гиразы и топоизомеразы IV, опосре­ дующих конформационные изменения в молекуле бактериальной ДНК, необходимые для ее нормальной репликации. Модификация мишени действия макролидов, кетолидов и линкозамидов является 50S субъединица бактериальной рибосомы.

Ф орм ирован ие м етаб о л и ч еско го «ш унта», ещ е один из механизмов антибиотикоустойчивости.

8.5. Микробиологический синтез антибиотиков 8.5. Микробиологический синтез антибиотиков Микробиологический синтез начинается с подготовки среды культивирования. С убстрат должен давать хорош ий рост и разм нож ение м икроорганизм ов, долж ен быть доступным и дешевым. Питательная среда стерилизуется предварительно в цехе изготовления либо непосредственно в биореакторе влажным паром под давлением. Одновременно идет подготовка посевного материала, чистая культура штамма-продуцента наращивается в последовательно возрастающем объеме (1-10-100 и более литров).

Следующий этап - это аэробная, глубинная, периодическая фер­ ментация в течение нескольких суток; это зависит от вида микроорганизмов-продуцентов, объема биореактора и др. В процессе ферментации поддерживается оптимальная температура, pH, р 0 2, условия постоянного перемешивания и аэрации (если используется аэробная культура микроорганизма-продуцента) и пеногашения с использованием химических и физических способов.

Так как антибиотические вещества являются вторичными метаболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры продуцента в идиофазу. Следовательно, целесообразно лимитиро­ вание роста продуцента в этой фазе. Таким лимитирующим фактором при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза, тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами - фосфаты.

Все это важно при составлении рецептур питательных сред для штамма — продуцента в процессе биосинтеза антибиотика.Так, среда для продукции пенициллина включает глюкозу - 1,5%, лактозу - 5% (лактоза снимает катаболитную репрессию глюкозы), аммония сульфат и фосфаты - 0,5-1%, кукурузный экстракт - 2предшественники антибиотика - фенокси- или фенилуксусная кислота —0,3-0,6%, мел - 0,5-1%, пеногаситель —0,5-1%; темпе­ ратуру ферментации поддерживают на уровне 22-26°С при pH от 5,0 до 7,5 и'аэрации 1 м3 воздуха на 1 м3 среды в 1 минуту;

продолжительность ферментации - 4 суток.

Так называемая «всеядность» актиномицетов обеспечивает им способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содержащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пшеницы и пр.), крахмал.

Тем не менее, применительно к каждому продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в регламентной докумен­ тации. Например, посевной материал Streptomyces kanamyceticus получают на соево-крахмальной среде и на ней же проводят основную ферментацию при 27-28°С в течение 4-5 суток при поддержании pH на уровне 7,1-7,6. При ферментации Str. floridae (продуцент виомицина, или флоримицина) рекомендуют среду, содержащ ую глюкозу или гидрол, соевую муку, кукурузный экстракт, нитраты, мел; температуру поддерживают в пределах 27-29°С, pH на уровне 7,0-7,3. В случае ферментации Str. erythreus в питательную среду добавляют пропиловый спирт, как предшест­ венник антибиотика эритромицина. Продуцент нистатина Str.

nourasei интенсивно потребляет аммонийный азот (не нитратный) и т.д.

Н апример, при культивировании Penicillium chrysogenum лактоза используется микроорганизмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 ч развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150-160 ч и это спо­ собствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и вы сокий уровень биосинтеза пенициллина, рентабельность производства антибиотика.

Для биосинтеза хлортетрациклина культурой Str. aureofaciens лучшим источником углерода в среде является глюкоза. Однако увеличение содержания глюкозы в среде выше 3% при неизменной концентрации других ком понентов зам етно сниж ает выход антибиотика.

Макро- и микроэлементы также существенны в биопродуцирую­ щей активности микроорганизмов. Многие из них входят в состав протоплазмы микробной клетки в качестве составных частей некоторых ферментов, другие элементы выступают в качестве 8.5. Микробиологический синтез антибиотиков компонентов, регулирующих осмотическое давление или изме­ няющих гидрофильность протоплазмы клеток. Недостаток фосфора в среде приводит к резкому изменению у актиномицетов обмена веществ, связанного с нарушением потребления и усвоения углеводов и азота. В свою очередь избыток фосфора в среде также резко влияет на метаболизм организмов. Так, продуцент стрептоми­ цина Streptomyces griseus весьма чутко реагирует на изменение концентрации фосфора в среде; при его повышении происходит резкое снижение выхода антибиотика. Аналогичные закономер­ ности наблюдаются у продуцентов антибиотиков тетрациклиновой природы (Streptomyces aureofaciens, Str. rimosus), у продуцента аурантина {Str. auranticus) и других микроорганизмов. Изменение концентрации серы в среде приводит к изменению физиологи­ ческого состояния мицелия P.chrysogenum и уровня биосинтеза пенициллина. Причем сера выступает в качестве своебразного конкурента фосфора при воздействии их на мицелий гриба. При повышении концентрации фосфора наблюдается развитие не продуцирующего антибиотик мицелия гриба I-III возрастных фаз.

Увеличение же концентрации серы, наоборот, способствует тому, что наибольшее количество биомассы гриба составляет продук­ тивный мицелий 1V-VI возрастных фаз.

Многие бактерии, продуцирующие антибиотики, размножаются лучше при нейтральной среде (pH 7,0). Хотя молочнокислые стрептококки, синтезирующие низин, размножаются в среде при pH равном 5,5-6,0. Большинство актиномицетов —антагонистов хорошо развивается в тех случаях, когда начальное значение pH среды находится в пределах от 6,7 до 7,8. В подавляющем боль­ шинстве случаев актиномицеты не размножаются при pH ниже 4,5-4,0.

Для большинства бактерий температурный оптимум лежит в пределах 30-37°С. Для Bacillus subtilis - продуцента грамицидина С - оптимальной температурой является 40 градусов Цельсия.

Хотя этот же микроорганизм может нормально размножаться и синтезировать антибиотик и при при температуре 28 градусов Цельсия, но при этом максимум накопления грамицидина в куль­ туральной среде запаздывает примерно на 24 часа. Актиномицеты продуценты антибиотиков, как правило, культивируются при температуре 26-30°С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут размножаться как при пониженных температурах (от 0 до 18°С), так и при повышенных (55-60°С). Для большинства мицелиальных грибов оптимальной признана температура 25-28°С.

Усилить синтез антибиотиков можно внося в культуральную среду метаболиты- предшественники. Для бензилпенициллина это фенилуксусная кислота, для макролидных антибиотиков пропионовая ки слота и пропиловы й спирт, для пептидного антибиотика грамицидина-S 1 L-фенилаланин и т.д.

Иногда применяется двухфазная ферментация: в начале быстро наращ ивается биом асса культуры на деш евом и доступном субстрате, а затем в среду культивирования вносятся метаболитып ред ш ественни ки, и зб ирательно усиливаю щ ие продукцию искомого антибиотика. Предшественники вносятся в фермента­ ционную среду в конце экспоненциальной фазы развития культуры микроорганизма (при периодической ферментации), потому что биосинтез антибиотиков возрастает в фазе замедленного роста (конец трофофазы) и достигает максимума в стационарной фазе, в идиофазе.

Затем проводится обработка ферментационной биомассы:

фильтрация, если антибиотик накапливается в культуральной жидкости; если антибиотик накапливается внутриклеточно, то проводится осаждение клеток, их разрушение с целью выделения антибиотика. Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В этих случаях, как правило, используют фильтрацию.

Качество твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации. Существует следующая закономерность - нативная бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом того факта, что высшие актиномицеты способны формировать нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит несколько легче, чем других бактерий.

Определенные трудности выделения антибиотиков из культу­ ральной среды обусловлены ее многокомпонентностью и малой концентрацией в них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться примерно до 30 г/л при 8%-м выходе из субстрата.

При этом сухие вещ ества после отделения мицелия обычно 8.5. Микробиологический синтез антибиотиков составляют порядка 3-6%, из которых лишь 15 - 30% являются антибиотическими соединениями. Поэтому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так, чтобы антибиотическое вещ ество переходило в ту фазу, из которой затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщелачиванием культуральной среды (новобиоцин), добавлением солей, щавеле­ вой кислоты (эритромицин) и т.д.

С целью выделения антибиотиков, их концентрирования на различных стадиях технологического процесса используются методы экстракции, ионообменной сорбции, хроматографические методы (тонкослойн ая хром атограф ия), осаж дения и др.