«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»
м еченны х ради онукли дам и м оноклональны х антител, тропны х к оп ухол есп ец и ф и чн ы м антигенам. К антигенам, продуцируем ы м многими злокачественны м и новообразованиями относятся альфаф етоп ротеи н, к а р ц и н о -эм б р и о н ал ьн ы й антиген, эп и тел и альн ы е м олочной железы и т.д. М еченны е радионуклидами опухолеспеци ф ичны е м оноклональны е антитела избирательно накапливаю тся в ткани, им ею щ ей вы ш еуказанны е антигены, что четко опреде л яется при сканировании.
М ини-антитела являю тся ценной альтернативой полноразм ер ным антителам при р азработке биосенсорны х устройств, б лаго д аря их стаб и л ьн о сти, н ебольш и м разм ер ам и вы сокой сп ец и п ри соед и н яю тся ф луор есц и р у ю щ и е белки, ф ерм ен ты и д руги е полипептиды. М и н и-антитела, как и полноразм ерн ы е м онокло нальны е антитела прим еняю т не только в м едицине, но и более ш ироко в молекулярной биологии, для изучения самых различных систем ы, в биотехнологическом производстве и др.
м оноклональны х антител относятся реакции им м уноф луоресцен ции и им м уноф ерм ентного анализа (рис.42,43).
Перспект ивы и проблемы применения моноклональны х антител П ути повы ш ения эф ф ективности терап ии м оноклональны м и антителами:
136 6. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ
Рис.42. Реакция иммунофлуоресценции. Антитела, м е ч е н н ы е флюорохромом - продукция антител, не вызывающих ответную иммунную реакцию, высокоспецифичные по действию, а при диагностике лучше малые по размеру (in vitro в биочипах, in vivo в липосомах, маркеры опухолей и др.);- получение биспецифических антител, они одним плечом гипервариабельного домена связываются с поверхностным антиге ном опухолевой клетки, а другим с антигенным рецептором Т-лимфоцитов, что обеспечивает их тесный контакт;
- снижение их иммуногенности: химерные и гиперхимерные (гуманизированные) антитела с разным соотношением мышиного и человеческого белка;
- перспективны технологии доставки лекарственных препа ратов при помощи конъюгатов противоопухолевых антител с фер ментом, расщепляющим лекарственный предшественник, прев ращая его в лекарство только в непосредственной близости к клеткам-мишеням.
Наиболее важными проблемами, мешающими эффективному использованию моноклональных антител являются гетерогенность опухолевой массы, изменчивость антигенной структуры патоген ных вирусов и бактерий, и слабая иммуногенная активность, аффиность антител. Гетерогенность опухоли означает, что далеко не все опухолевые клетки могут содержать антиген, против которого направлено данное специфическое антитело. Кроме того, вследствие генетической нестабильности в опухолевых клетках часто происходят мутации, в том числе связанные с поверхност ными антигенами. В результате часть клеток легко «ускользает»
от терапевтического действия данного моноклонального антитела.
Подобная ситуация может возникать и с антигенами микроорга низмов (например, высокая изменчивость поверхностных анти генов ВИЧ, гриппа и др.). Недостаточная иммуногенность или низкая аффиность антител также значимый фактор, особенно это касается неполноразмерных антител.
ЭВОЛЮЦИЯ
7.1. Характеристика ферментов В 1836 году Т.Шванн выделил из желудочного сока вещество, способное расщеплять и растворять белки, это был пепсин. В том же году Я. Берцелиус опубликовал работу, в которой писал: «Мы имеем достаточные аргументы для предположения о том, что в растениях и животных между тканями и жидкостями происходят тысячи каталитических процессов, вызывающих множество различных расщеплений. В них, возможно, мы откроем в будущем каталитическую силу живых тканей, из которых построены телесные органы».Ферменты микробного, растительного и животного происхож дения используются в медицинской практике как биопрепараты с целью диагностики, лечения и профилактики различных болезней человека. Особенно они эффективны при терапии наследственной патологии, обусловленной отсутствием либо недостаточностью того или иного фермента в организме.
Задачами биотехнологии ферментов являются:
- разработка технологического процесса получения фермент ных препаратов для лечения и профилактики болезней человека;
- разработка диагностических тест-систем, аналитических методов, основанных на каталитической активности и стерео избирательности ферментов.
Ферменты - главные рабочие инструменты всего живого. Они отвечают почти за все химические реакции, проходящие в живом существе: обеспечивают энергией и строительными материалами;
создают и разрушают сигнальные молекулы, нужные для регуля ции жизненных процессов; защищают организм от чужеродных веществ. Еще ферменты перезаписывают и размножают наследстХарактеристика ферментов венную ин ф орм аци ю, то есть син тези рую т Д Н К и РН К. Н аконец, участвую т в р еал и зац и и этой инф орм ации - в си н тезе сам их себя и д р у ги х белков.
секретирую тся во внеш ню ю среду (экзоф ерм енты ). М ноги е эн д о кл етки ти п и чен, х ар актер ен для вида, ген ети ч еск и д ете р м и н и р о кон центраци и в клетке и ин дуц ибельн ы е ф ерм енты, концентрация ко то р ы х за в и с и т о т н ал и ч и я су бстрата. К л етк а м ож ет сохран ять ж и зн ед еятел ьн о сть без ин дуц ибельн ы х ф ерм ен тов. Ф ерм енты со ставл я ю т осн о вн у ю м ассу ф у н кц и о н ал ьн ы х б елков клетки.Д ля д вад ц ати м инут, позж е они долж ны бы ть зам енены. Д ругие энзим ы они будут р асщ еп лен ы и удалены из организм а.Ф ерм ен ты нам ного эф ф екти вн ее х им и чески х катализаторов, кром е того более избира тельны : м огут извлекать из слож ной см еси только одно вещ ество и п ревращ ать его не в несколько п родуктов, а в один.
Начало изучению структуры ферментов было положено Д. Самнером, который впервые установил белковую природу ферментов. К настоящему времени описано около ISO ферментов в кристаллической форме, т.е. расшифрована их структура.
Как и другие белки (рис.44), ферменты характеризуются первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурой:
- первичная структура - это последовательность аминокислот, соединенных между собой пептидными связями;
- вторичная структура - регулирует конформацию полипептидной цепи в виде спирали посредством водородных связей между СО- и NH-группами на отдельных участках цепи;
- третичная структура - проявляется специфической укладкой полипептидной цепи в глобулу с образованием гидрофобного ядра молекулы фермента.
Стабилизируют ее все виды химических связей. Сильные связи - пептидные и дисульфидные; слабые - водородные, гидрофобные и электростатические;
- четвертичная структура - организуется в результате ассоциации двух и более глобулярных единиц.
Первичную структуру ферментов определяют методом секвенирования определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи (разрабаты ваются методы детекции первичной структуры белка путем пропускания полипептидаой цепи через нанопоры; при прохождении через нее конкретной аминокислоты подается соответствующий сигнал детекции). Третичную структуру фермента определяют ренттеноструктурным анализом.
Первичная структура Бторвчяаа структура Третячяаа стру п ура Четвертичная структура В структуре фермента различают активный центр и аллостерический, т.е. «имею щий иную пространственную структуру» центр. Активный центр фермента образован из остатков аминокислот, находящихся в составе различных участков полипептидной цепи или различных полипептидных цепей, пространственно сближенных. Образуется на уровне третичной структуры белка-фермента Активный центр представлен сосредоточением неполярных химических групп, специфически взаимодействующих с субстратом. Он не имеет определенных топографических границ, очерчивающих его от остальной части полипептида. Активные центры ферментов включают специфические аминокислотные остатки, являющиеся донорами (-СООН, -NH3, SH) или акцепторами (-СОО-, -NH2, -S-) протонов.
Один и тот же тип активного центра может использоваться в разных ферментах.
Так, ферменты, гидролизующие ДНК (экзонуклеазы и эндонуклеазы), активируют воду с помощью комплекса ионов магния с карбоксильными группами и присоединяют ее к ДНК, которая при этом расщепляется на фрагменты. Такой же тип активного центра имеет фермент ДНК-полимераза, но она сшивает два основания через фосфатные группы. Тот же активный центр, но активирует не воду, а гидроксильную группу сахарного остатка основания. Поэтому вместо расщепления ДНК на фраг менты, наоборот, имеет место их соединение с образованием из фрагментов целой молекулы ДНК.
Если специфичность взаимодействия фермента с субстратом обусловлена свойствами активного центра, то аллостерический центр имеет значение в регуляции 7.1. Х аракт ерист ика ф ермент ов каталитической активности фермента. Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, при присоединении к которому низкомолекулярных соединений - ингибиторов или эффекторов изменяется третичная структура белковой молекулы. Вследствие этого меняется конфигурация активного центра, сопровождаю щаяся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента.
Этот механизм лежит в основе аллостерической регуляции каталитической активности фермента, ее усиления либо подавления.
Для объяснения пространственного взаимодействия между ферментом и субстра том Э.Фишер предложил модель «ключ к замку». В последующем были разработаны различные математические модели для описания кинетики ферментативных реакций (Моно, Михаэлис и др.). В 1948 году Л.Полинг предположил, что каталитическое действие ферментов достигается стабилизацией переходного состояния химических реакций путем взаимодействия с активным центром фермента, что было в дальнейшем подтверждено экспериментально. Согласно гипотезе «индуцированного соответствия»
(модель Кошланда) ферментативная активность может регулироваться небольшими молекулами, отличными от молекул субстрата или продуктов реакции. Было показано существование аллостерических центров, разработаны методы регуляции активности ферментов Свойства ферментов:
- высокая эффективность действия ферментов. Они могут ускорять реакцию в 1 0 4 О1 раз;
- ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции, т.е. они не расхо дуются (но некоторые ферменты в конце реакции подвергаются модификации и даже распаду, а не освобождаются в неизменном виде). Очень незначительное количество фермента катализирует расщепление большого количества субстрата;
«