«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

половы м клеткам. С ом атические клетки-миш ени использую тся при заболеваний. К летки пораж енны х тканей и органов извлекаю тся и вне о р ган и зм а тран сф и ц и р у ю тся ген ети ческо й кон струкц и ей, системно в сосудистое русло (in vivo), или локально - аэрозольно в легочную ткань, инъекция в опухолевую ткань и др. (in situ).

По типу вект оров Реш аю щ им условием успеш ной ген о тер ап и и я вл яется о б ес­ печение эф ф ективной д о ставки, то есть тр ан сф ек ц и и ч у ж ерод ­ ного гена в клетки-м иш ени, обеспечение д лительного ф ункц ио­ нирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы ген а(р и с.1). Э фф ективность трансф екции и интеграцион­ различных способах доставки в ДНК клетки-мишени различна.

Для доставки нового генетического материала, обеспечивающего терапевтический эффект в клетки-мишени индивида необходимы векторы. В качестве вектора для переноса фрагмента ДНК (гена) в клетку используются:

- вирусы (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные и др. вирусы);

- липосомы либо специально сконструированные белковые и пептидные векторы, обладающ ие сродством к определенным типам тканевых клеток (лиганд-рецепторный метод;

- физические методы (электропорация, баллистическая транс­ фекция и др.).

Рис. 1. Схематическое изображение трансформации Вирусные векторы или генетические конструкции, основанные на вирусных последовательностях, способных к активной транс­ дукции, а в некоторых случаях и к длительной экспрессии чуже­ родных генов в клетке-мишени используются чаще других век­ торов. При этом в 40% случаях используются аденовирусы, в 30% ретровирусы, в 16% - аденоассоциированные вирусы, в 10% вирус простого герпеса, в 4% - лентивирусы, вирус папилломы и др. Вирусы способны инфицировать клетку и вместе с клони­ руемым фрагментом ДНК легко интегрировать в геном клеткимишени.

Для того чтобы реконструировать вирусы в векторы, в них с помощ ью генно-инженерных методов:

- оставляются только последовательности, кодирующие синте капсида вируса. К прим еру, прим еняю тся «пакую щ ие» р етр о ­ вирусные векторы (рис.2), когда в качестве вектора используются только гены, кодирующие капсид этого вируса и трансфицируемые терапевтические гены, исключив при этом те гены ретровирусов (сем. Retroviridae), которые могли бы вызвать в трансфицируемом организме патологию, в частности инсерционный мутагенез или индукцию злокачественного роста. Вирусная РНК проникает в ядро клетки с последующей экспрессией терапевтического гена.

Recombinant H t« Recombinant Примечание. Обезвреженные РНК-вирусы (ретровирусы), содержащие требуемые гены вместе с генами ревертазы (на схеме 1), направляются к клетке. После того как клетка с помощью рецепторов опознает вирусную оболочку (2 ), вирус внедряет в клетку РНК (3). В клетке РНК с помощью ревертазы переписывается в ДНК (4) и проникает в ядро соматической клетки (5). Там синтезированная чужеродная ДНК, несущая нужные гены и некоторые вирусные гены, встраивается в ДНК самой клетки (6 ). Далее клетка при делении синтезирует копии обновленного генома, синтезирует мРНК (7), необходимые терапевтические белки (8). Реплицированная вирусная РНК покрывается капсидом (9) и заражает другие клетки (10). С сайта - moikompas.ru.

1.1. Технологии генной терапии Однако эти векторы не годятся для введения ДНК-фрагментов в неделящиеся клетки человека, например, в нейроны. Они также мало пригодны для переноса генов в клетки, отличающиеся низкой митотической активностью (к примеру, в клетки эпителия дыха­ тельных путей);

—удаляются последовательности вирусных нуклеотидов, ответ­ ственные за репродукцию вируса. Имеет место временная экс­ прессия терапевтического гена в составе вектора вне ядра клетки.

Это аденовирусные векторы (сем. Adenoviridae), не обладающие онкогенностью, а такж е непатогенны е аденоассоциированны е вирусы (сем. P arvoviridae)', они позволяю т вводить терап ев­ тические гены в неделящиеся клетки, в отличие от ретровирусов;

- в кач естве вектора исп о льзу ется такж е вирус простого герпеса (ceu.H erpesviridae). Как и аденовирусы, вирус герпеса подвергается генно-инженерной обработке, ведущей к утрате его способности к репродукции в клетке. В отличие от р е т р о - и аден ови русо в, не об лад аю щ и х узким тр о п и зм о м к клеткам о рган и зм а, герпесвирусы изб и р ател ьн о инфицирую т только нейроны. П оэтому эти векторы предпочтительны при генной терапии заболеваний нервной системы.

Л ипосом ы — м икроскопические ф осфолипидны е везикулы, образованные одной или несколькими бислойными мембранами, которые служат транспортным средством для доставки химио­ препаратов, белков, ДНК, антисмысловых олигонуклеотидов и т.д.

Созданы липосомы, обладающие разными свойствами. Например, катион ны е (по л о ж и тел ьн о заряж енн ы е) липосом ы, которы е связываются с отрицательно заряженной молекулой ДНК, образуя ДНК-липидный комплекс —липоплекс. Липоплексы легко обра­ зуются, могут нести достаточно крупные генетические конструк­ ции, относительно нетоксичны и неиммуногенны; биосовместимы, защ ищ аю т вклю ченную м олекулу ДН К от ф ерм ен тативн ой деградации при контакте с биологическими жидкостями. Прони­ кающая способность липосом зависит от их липидного состава, размеров, природы инкапсулированной молекулы, адресующего В отличие от других липосом, pH-зависимые липосомы, благодаря вклю чению в их состав некоторы х белков, например, гемагГЕННАЯ ТЕРАПИЯ глютинина или HVI белка вируса Сендай, теряют стабильность в кислой среде. Считается, что при таком типе липосом трансфи­ цируемая ДН К долж на бы стро о свобод иться от липидной оболочки в эндосоме и с большей вероятностью может оказаться в ци топлазм е, не п одвергаясь л и зосом альной деградации.

Достаточно эффективны катионные липиды, удерживающие ДНК за счет электростатических взаимодействий.

Лиганд-рецепторный метод введения экзогенной ДНК в клетки хозяина. Для такой цели используются конъюгаты ДНК с трансферрином или гликопротеином, для которых на многих клетках имеются специфические рецепторы. После связывания с рецеп­ тором конъюгаты ДНК поглощаются клеткой. Хотя вероятность встраивания введенной ДНК в геном хозяина очень невелика, все же трансфицированный ген может временно выполнять свои функции.

Физический метод введения ДНК-конструкций - электропора­ ция (под действием на клетки импульсов электрического поля высокой напряж енности имеет место обратимое увеличение проницаемости мембраны, образование пор диаметром около 0,5 нм.);

метод баллистической трансфекции с использованием генного «пистолета» (Д Н К -конструкции конъю гирую т с частицам и тяжелых металлов - золота или вольфрама диаметром 1-3 мкм;

обстрел органов и тканей, глубина проникновения около 1 мм;

рис.ЗА и ЗВ); разработана технология микроинъекций ДНК в мышечные клетки - миоциты.

Комбинированный вектор. Эффективно сочетанное использо­ вание лиганд-рецепторного и вирусного векторов, т.а рецепторопосредованный перенос генов. ДНК-последовательность нуж­ ного гена соединяют с определенным веществом (например, гликопротеином), который обладает высоким сродством к опреде­ ленному мембранному рецептору трансформируемой клетки (например, гепатоцита). Полученный комплекс - терапевтический ген и гликопротеин соединяют с аденовирусом, обеспечивающим проникновение генной конструкции в ядро клетки. Такой комбини­ рованный вектор обеспечивает эффективную адресную доставку гена в определенные ткани и органы, пересечение плазматической мембраны и доставку к определенной мишени внутри клетки.

1.1. Технологии генной т ерапии Рис.ЗА. Многоразовый генный пистолет компании « Powderject»

Рис.ЗВ. Одноразовый генный пистолет компании «Powderject»

П о способу введения генов Генная терапия ex vivo осуществляется путем переноса генети­ мозга, гепатоциты, астроциты, фибробласты и др.), с последующей реимплантацией этих клеток. Перенос генов ex vivo предполагает вы деление и культивирование клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфицированных клеток и реинфузию их тому же пациенту. В больш инстве допущ енных к клиническим П реимущ еством генной терапии ex vivo является то, что можно полностью охарактеризовать полученны е трансф орм ированны е многочисленные клоны этих клеток и отобрать клоны с высоким уровнем экспрессии требуемого гена, а также исклю чить клоны с опасны м и тр ан сф о р м ац и ям и, которы е м огли бы нан ести вред организм у.

нантного генетического вектора с терапевтическим геном непо­ средственно в организм, в достаточном количестве. Пути введения генной конструкции in vivo:

- в ткань путем инъекции (почки, тимус, поперечно-полосатые мышцы и другие органы; рис.4);

Рис.4. Генная терапия in vivo - инъекция терапевтического 1.1. Технологии генной терапии - внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфицируемый орган;

- аэрозольное введение при легочной патологии.

По типу генотерапии:

- коррекция функции дефектного гена. Методы коррекции активн ости д еф ектны х генов (при м утациях, изм еняю щ их небольшой участок ДНК) или их замены нормальным пока еще отрабатываются в условиях лабораторий;

- введение терапевтического гена. На данном этапе развития технологии генной терапии клинические исследования сф окусированы на внесении дополнительного гена (генов), введении в организм экспрессирующегося терапевтического гена при условии сохранения в клетке дефектного или «больного» гена.

Коррекция или замещение последнего методически значительно сложнее. Терапевтический ген позволяет восполнить недостаю­ щую в организме функцию - это пополняющая (augmentative) генная терапия. Предпочтительны генетические конструкции, содерж ащ ие наряду с ф ункционально активны ми ген а м и аналогами деф ектны х генов (терапевтические гены ), еще и последовательности ДНК, регулирующие экспрессию дефектного - подавление функции «больного» гена (antisence RNA). При инфекциях, опухолевой трансформации и иной патологии может иметь место избыточная функция гена, которую необходимо пода­ вить. Подавление репликации мРНК дефектного гена осущест­ вляется двумя путями - либо терапия антисенс РНК (это подав­ ление работы гена на уровне мРНК путем экспрессии в клетке г структур, обеспечивающих синтез РНК, комплементарной мРНК дефектного гена) либо терапия антисмысловыми РНК (это синте­ тическая РНК, комплементарная мРНК дефектного гена, будучи введенной в клетку, она связывается с мРНК и трансляция этой мРНК специфически ингибируется; такая синтетическая РНК была названа антисмысловой, в связи с обратным по отношению к мРНК расположением в ней нуклеотидов). Принципиально терапия антисенс РНК и терапия антисмысловыми РНК схфцц^ д, 1 е ю т Например,чтобы подавить экспрессию дефектного гена, можно поступить следующим образом: выделить этот фрагмент ДНК из генома и поместить его в генетическую конструкцию в перевер­ нутом (антисмысловом) положении (рис.5). При этом будет синте­ зироваться антисмысловая РНК, которая ничего не кодирует, но В результате наступает посттранскрипционный генетический сайленсинг - остановка трансляции, разрушение мРНК гена-мишени и резкое снижение или даже полное прекращение его экспрессии.