WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 17 | 18 || 20 | 21 |   ...   | 35 |

«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

-- [ Страница 19 ] --

Клон, продуцирующий антитела одной специфичности - моно­ клональные антитела можно получить гибридомной технологией (путем гибридизации В-лимфоцитов с миеломными клетками) и технологией рекомбинантной ДНК (рекомбинацией генов, коди­ рующих синтез константных и вариабельных доменов антител).

Вплоть до открытия гибридомной технологии и технологии рекомбинантной ДНК антитела использовались в качестве лечеб­ ного препарата (иммунные сыворотки, их введение в организм вызывало развитие пассивного иммунитета) или диагностикума (препараты, содержащие готовые антитела, позволяющие опре­ делять in vitro комплементарные им антигены).

Внедрение в медицинскую практику гибридомной технологии позволило получать и применять высокоспецифичные, высоко­ избирательные моноклональные антитела не только для нейтра­ лизации возбудителя, но и с целью иммуносупрессии при трансплантации органов и тканей, для адресной доставки лекарств к тем или иным тканям организма, для лечения соматической патологии, онкозаболеваний и др.

Технологии рекомбинантной ДНК позволили получать не только полноценные, двухвалентные, двухцепочечные (Fcконстантный фрагмент, Fabl и РаЬ2-вариабельные фрагменты ), но и одноцепочечные, неполноразмерные (только Fab-фрагмент), так называемые мини-антитела, используя с этой целью генети­ чески модифицированные клетки микроорганизмов, растений и

В ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ

122 6. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА животных. Рекомбинантные антитела, как полноразмерные, так и их фрагменты составляют треть всех разработанных в биотехно­ логии рекомбинантных белков.

Рынок моноклональных антител является наиболее быстро раз­ вивающимся сегментом фармацевтической индустрии. К примеру в 2007 году реализация терапевтических моноклональных антител принесла только биотехнологическим компаниям США больше 26 млрд. долларов прибыли, основная часть моноклонов была востребована для терапии онкологических и аутоиммунных заболеваний. А препарат «Ритуксан» (применяется при опухолях и аутоиммунных артритах), разработанный на основе терапев­ тических моноклональных антител по объему реализации занимает шестую позицию среди всех медицинских препаратов. Произ­ водством моноклональных антител в настоящее время занимаются более 200 биотехнологических компаний, в основном из США, Японии и Германии.

Характеристика антител На рисунке 39 представлена общеизвестная структура полно­ размерного бивалентного антитела, имеющего легкие и тяжелые цепи, константную и вариабельную части, два активных центра.

Рекомбинантные антитела (химерные, гуманизированные, конъю­ гированные; двуцепочечные и одноцепочечные или мини-антитела) по структуре и функциональным характеристикам сущест­ венно отличаются (табл. 9, рис.40).

а) химерные антитела Химерные (или гибридные) антитела (chimaeric antibodies) это антитела, в которых константный домен мышиных антител замещ ен соответствую щ им константны м доменом им м уно­ глобулина человека. При помощи рекомбинантной технологии соединяю тся разнородны е молекулы ДН К, кодирую щ ие человеческий Fc-фрагмент и мышиный Fab-фрагменты антитела.

Поскольку иммуногенные и эффекторные (взаимодействие с системой комплемента, фагоцитами и др.) свойства антител опре­ деляются в основном его константным доменом, а специфичность взаимодействия с антигеном определяется вариабельным домеХарактеристика антител Рис. 39.Полноразмерное, двухцепочечное, двухвалентное антитело.

Антитело состоит из четырех белковых молекул - двух больших, или «тяжелых»

Н-цепей и двух маленьких,«легких» L-цепей. Вариабельная область отвечает за связывание антигена, именно в нее вносятся изменения при соматическом ном, то, естественно, химерные антитела (Fc-фрагмент челове­ ческий, а Fab-фрагмент мыши­ ный) более эффективны и вызы­ вают значительно меньше ослож­ нений при сохранении специфич­ ности, аффинности и авидности, свойственных мышиным моно­ клональным антителам.

тела В структуре гуманизирован­ ных антител мышиное происхождение имеют только небольшие антигенсвязывающие гипервариабельные участки (CDR) вариа­ бельного домена — Fv-фрагмента. Если у химерных антител варибельный домен полностью является мышиным, то у гумани­ зированных только его часть животного происхождения. Fvфрагмент состоит из трех CDR участков (CDRI, CDRII, CDRIII).

С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуще­ ствляют последовательную замену только одного или двух CDR

6. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ

участков ДНК человека на соответствующий CDR участок ДНК мыши. Таким образом гуманизированные антитела в отличие от химерных содержат еще меньше чужеродного белка (только CDR мышиного происхождения) и соответственно вероятность иммун­ ного отторжения существенно ниже.Это в основном снимает проблему иммунного ответа на введение антител больному с тера­ певтическими или диагностическими целями.

Таблица 9. Типы моноклональных антител Химерные Гуманизированные Конъюгированные IgG2a, мышиный, анти-СД20, меченный Примечание.Т№а - фактор некроза опухолей; EGFP - рецептор эпидермального фактора роста; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов; СД20, СД25, СДЗЗ, СД52поверхностные опухолевые антигены.

в) одноцепочечные антитела Наряду с полноразмерными химерными и гуманизированными антителами генная инженерия позволяет получать и одноцепочеч­ ные, мини-антитела, состоящие только из участков Fv- фрагмента (scFv). Это вариабельные домены легких и тяжелых цепей (VI и V h ) иммуноглобулина, ковалентно соединенные гибким пептидным линкером; константные домены исходного мышиного антитела полностью отсутствуют. Таким образом, одноцепочечные мини­ антитела представляют собой минимальный фрагмент молекулы иммуноглобулина, который обладает достаточно хорошей антигенсвязывающей активностью.

г) конъюгированные антитела К моноклональным антителам присоединяют лекарственные соединения (цитостатики, токсины и др.) или диагностические метки (радиоактивны е частицы, флуоресцирующ ие вещ ества), соответственно с целью адресной доставки к клеткам-мишеням либо детекции последних. Моноклональные антитела, конъюгиро­ ванные с токсинами называются иммунотоксинами.

М оноклональные антитела можно получать также в ткани трансгенных растений либо синтетическим путем.

Трансгенны е раст ени я (чащ е всего табак) использую т в научно-исследовательских лабораториях для получения, как съедобных вакцин, так и моноклональных антител против ново­ образований (опухоли киш ечника, легких и др.) и инфекций (против герпеса, бешенства, стрептококковой инфекции и др.).

Абзимы (антитела-ферменты, AntiBody enzyme) —это синте­ тические, каталитические антитела, способны е осущ ествлять катализ реакций подобно ферментам.

Например получены абзимы, специфически распознающие и расщепляющие кокаин, антиген ВИЧ gp41 и др.

6.2. Технологии получения антител - поликлональные антитела - путем гипериммунизации;

- полноразмерные моноклональные антитела - гибридомной технологией;

- одноцепочечные, химерные, гуманизированные и конъюгиро­ ванные моноклональные антитела - технологией рекомбинантной ДНК.

Технологии гипериммунизации и гибридомы позволяют полу­ чать полноразмерные, двухцепочечные антитела(соответственно п о л и - и моноклональные). Технологии рекомбинантной ДНК позволяют получать одноцепочечные (химерные, гуманизирован­ ные, конъюгированные) антитела.

Гибридомная технология Основные этапы гибридомной технологии:

— иммунизация линейных мышей либо других лабораторны животных, соответствующими антигенами (к примеру, HBs-Ag или

126 6. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ

поверхностный белок СД4 вируса СПИД). Используются кратко- и долговременные схемы повторной иммунизации с подкожным, внутрибрюшинным либо внутривенным введением антигена;

- выделение селезеночных лимфоцитов (способны к синтезу антител одной специфичсти) у иммунизированных животных;

- подготовка мышиных миеломных лимфоидных клеток (клетки миеломы - это малигнизированные В-лимфоциты, способные к неограниченному росту и размножению);

- слияние (гибридизация) миеломных и селезеночных клеток в присутствии соединений, усиливающих процесс слияния клеточ­ ных мембран (к примеру, ПАГ);

- выращивание гибридных клонов; гибридомы- продуценты моноклональных антител от клеток селезенки унаследовали спо­ собность к продукции антител, а от миеломных клеток способ­ - отбор, клонирование гибридом, синтезирующих антитела необходимой специфичности (определение в серологических реакциях);

- накопление гибридомных клеток in viv o в асцитической жидкости или in vitro в культуре клеток;

- выделение, концентрирование и очистка (осаждение солями, аффинная хроматография, гёль-фильтрация) моноклональных антител;

- анализ авидности и аффинности антител, определение их титра. Моноклональные антитела идентичны по классу и типу иммуноглобулинов, по специфичности, авидности и аффинности.

Однако гибридомная технология, основанная на получении м оноклональны х антител из мыш иных лим ф оцитов имеет определенные ограничения для применения в медицинской прак­ тике. Эти антитела характеризуются антигенной чужеродиостью для человеческого организма и при их использовании с терапевти­ ческой целью имеет место реакция иммунного отторжения, они неспособны в полной мере выполнять эффекторные функций в организме человека. Кроме того, гибридомы, подобно большин­ ству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой клеточной плотности и требуют сложных и дорогих питательных сред.

6.2. Технологии получения антител Технологии рекомбинантной Д Н К Получение рекомбинантных антител предполагает, во-первых, их разнообразие по специфичности взаимодействия с антигенами, соизмеримое с количеством различных клонов В-лимфоцитов в организме и, во-вторых, их промышленную продукцию, используя в качестве продуцента модифицированные микроорганизмы или эукариотные клетки.

Для получения рекомбинантных антител с разной специфич­ ностью, с различными гипервариабельными участками в настоя­ щее время широко используют комбинаторные библиотеки одно­ цепочечных (scFv) антител и Fv-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli; это метод фагового дисплея.

Для этого, используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК (к примеру, кодирующие CDR участки мышиных антител, полученных гибридомной технологией). Проводят раздельную ПЦР-амплификацию кДНК, кодирующих Н - и L-цепи. Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфи­ ческое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей. кДНК, кодирующие, сответственно Н- и L-цепи Fv-фрагмента встраивают в вектор, в геном бактериофага.

Затем среди рекомбинантных бактериофагов, in vitro отби­ раются те, которые в большем количестве экспрессируют белок CDR, способный связываться со специфическим антигеном.



Pages:     | 1 |   ...   | 17 | 18 || 20 | 21 |   ...   | 35 |
 


Похожие работы:

«СОГЛАСОВАНА УТВЕРЖДАЮ Заместитель директора по НМР Директор гимназии №2 _ Т.В.Лимберг _И.А.Шендрик _ _ 2013 года _ _2013 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА По курсу Биология Ступень обучения основное общее образование для 6 А, 6Б, 6 В, 6Г, 6 Я классов РАЗРАБОТЧИК: Передериева Елена Валентиновна учитель биологии ПРИНЯТА На заседании методического объединения Протокол № от _ _ 2013 года Руководитель МО _ Е.В. Белобородова 2013 г. Пояснительная записка Рабочая программа курса биологии составлена на основе...»

«Красная Книга России Животные ПРЕДИСЛОВИЕ В Красную книгу России занесены редкие и исчезающие животные, растения и грибы, постоянно или временно обитающие в состоянии естественной свободы на территории, континентальном шельфе и в морской экономической зоне Российской Федерации, которые нуждаются в специальных государственно-правовых действиях, входящих в компетенцию федеральных органов исполнительной власти. Ведение и издание Красной книги Российской Федерации - это также и выполнение...»

«ЕКАТЕРИНБУРГ, 2007 В. Л. ВЕРШИНИН БИОТА УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ЕКАТЕРИНБУРГ, 2007 2 В. Л. Вершинин Биота урбанизированнных территорий. Екатеринбург, 2007. 85 с. Пособие составлено на основе литературных и оригинальных материалов по городской экологии. Приводятся различные точки зрения на ландшафтную типизацию, генезис человеческих поселений, структуру фауны и флоры городских территорий. Содержатся сведения, относящиеся к методологии и практике экологического мониторинга. Выделены общие...»

«Ержанов Н.Т. Перспективы сохранения и рационального использования зверей Казахского мелкосопочника // Ержанов Н.Т. Редкие и исчезающие млекопитающие Казахского мелкосопочника. – Караганда: Изд-во КарГУ, 2001. – С.112-146. Животный мир — один из важнейших компонентов биосферы, который занимает большой удельный вес в составе биогеоценозов. Генофонд диких животных Казахстана уникален. Так, по данным Книги генетического фонда фауны Казахстана /Книга генетического фонда фауны Казахской ССР, 1989/,...»

«Байбурин Альберт Кашфуллович Ритуал в традиционной культуре Структурно-семантический анализ восточнославянских обрядов. СПб.: Наука, 1993. Монография посвящена теоретическим аспектам изучения ритуала. Основное внимание уделяется проблеме функционирования ритуала, определению его места в системе традиционной культуры. С этой целью анализируются основные типы восточнославянских обрядов (обряды жизненного цикла, календарные, окказиональные), описываются их структура, функции, семантика....»

«Флора и растительность Красноярского края УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Направление подготовки: 050100.62 Естественнонаучное образование Профиль Биология КРАСНОЯРСК 2009 1 УМКД составлен д.б.н. Е.М. Антиповой Обсужден на заседании кафедры биологии и экологии _23__сентября_2009 г. Заведующий кафедрой А.Н. Васильев д.б.н., профессор Одобрено научно-методическим советом специальности Биология _09__октября_2009 г. Председатель НМСС Е.Н. Афанасова 2 Протокол согласования рабочей программы...»

«СОВРЕМЕННАЯ АНТРОПОЛОГИЯ Минск Беларуская навука 2011 УДК 572.5 Социальная антропология / Л.И. Тегако; А.И. Зеленков НАН Беларуси, Ин-т истории. – Минск: Беларус. навука, 2011. – 224 с. ISBN В книге освещаются основные проблемы антропологической науки с позиции интеграции гуманитарных и биологических знаний. Представлены новые междисциплинарные направления в антропологии – социокультурное, психологическое, экономическое и другие. Обращено внимание на социальные проблемы современности. Издание...»

«ПРОЦЕСС ЭВОЛЮЦИИ И МЕТОДОЛОГИЯ СИСТЕМАТИКИ А.П. Расницын ОТ АВТОРА Эта книга представляет некоторый итог моих размышлений о теоретических основах таксономического круга биологических дисциплин. В этот круг я включаю разделы биологии, анализирующие организменный уровень структуры и происхождения биологического разнообразия. Структуру биоразнообразия на этом уровне разрабатывает систематика с ее методологическим и лингвистическим аппаратами (таксономией и таксономической номенклатурой),...»

«ГОРЫ И ГОРЦЫ АЛТАЯ И ДРУГИХ СТРАН ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЕВРАЗИИ Материалы международного симпозиума Горно-Алтайск 2000 Печатается по решению редакционно-издательского совета ГАГУ Горы и горцы Алтая и других стран Центральной Евразии: Материалы международного симпозиума / Под. Ред.: А.М. Маринина. Горно-Алтайск: РИО Универ-Принт, ГАГУ, 2000, 234 с. Международный симпозиум Горы и горцы Алтая и других стран Центральной Евразии посвящен важной географической проблеме – устойчивому развитию горных территорий....»

«№ Сроки Наименование мероприятий Ответственный п/п исполнения Агентство природных Проведение семинаров-совещаний для ресурсов и экологии субъектов малого и среднего бизнеса по Архангельской вопросам соблюдения природоохранного март-июнь области, ОГУ 1. законодательства в муниципальных Госэкоинспекция по образованиях. Архангельской области Агентство природных ресурсов и экологии Архангельской Проведение торжественного мероприятия области, ФГУ НП посвященному объявлению Дней защиты от март 2....»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.