WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 16 | 17 || 19 | 20 |   ...   | 35 |

«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

-- [ Страница 18 ] --

Трансгенные растения моркови, синтезирующие рекомбинантные белки ИЛ 10 и ИЛ получают совместным культивированием каллусных культур, индуцированных из семядолей зародышей предварительно набухших семян с культурой рекомбинантного штамма A. tumefaciens, несущего гены, кодирующие синтех этих белков. Гены, кдирующие интелейкины 10 и 18 человека, клонируют с помощью RT-PCR с использованием мРНК, выделенной из кДНК мононуклеарных клеток крови при помощи соответствующих праймеров. Для этого фрагменты ДНК обрабатывают эндонуклеазами рестрикции и встраивают в плазмиду. Идентифицируют плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности кДНК ИЛ путем секвенирования.

В плазмиду также встраивается промотор и полилинкер, необходимые для экспрессии рекомбинантного белка в клетке-продуценте. Последующий селективный отбор и регенерация растений-трансформантов проводится на среде Мурасиге-Скуга с кинетином и канамицином. Растения с хорошо развитой розеткой листьев переносятся в условия теплицы при освещении 15 О Олюкс, с чередованием дневного и ночного режимов освещения в соотношении 16:8 часов и температурного режимов 24 градуса Цельсия в течение дня и 18-20 градусов Цельсия в течение ночи. Наличие в геноме трансгенных растений моркови фрагментов, соответствующих генам ИЛ 10 и ИЛ определяется при помощи ИФА-анализа.

- фермент гликоцереброзидаза из трансгенного табака. Недостаток липосомального фермента гликоцереброзидазы в организме вызывает синдром Гоше.

Единственным видом терапии этого заболевания является внутривенное введение гликоцереброзидазы. Долгое время этот белок получали из плаценты человека, на поддержание жизни одного пациента в течение года требовалось 160000 долларов.

Переключение продукции гликоцереброзидазы на культуру клеток млекопитающих снизило стоимость этого препарата, однако не вытеснило его из группы самых дорогих лекарств. В дальнейшем были получены высокопродуктивные трансгенные растения табака, в которых содержание гликоцереброзидазы человека варьировало от 1 до % растворимого в клетке белка. Получение рекомбинантной гликоцереброзидазы из таких растений позволит значительно снизить её стоимость.

5.7. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в клетках млекопитающих Производство рекомбинантных белков с использованием в качестве продуцентов клеток млекопитающих осуществляется по двум направлениям:

- культивирование генетически модифицированных клеток животных in vitro в биореакторах;

- использование трансгенных животных, продуцирующих человеческие белки (молочная железа животных - биореактор рекомбинантных белков).

5. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА

Биосинтез рекомбинантных белков in vitro:

Для биосинтеза рекомбинантного белка in vitro необходимо получить стабильно продуцирующие промыш ленные культуры клеток - клеточные лини (к стандартным культурам относятся клетки хомячка СНО и BNK, др.). Вначале клеточная культура трансф ицируется вектором, несущ им целевой ген. Д алем для получения суперпродуцирую щ его ш там м а проводится ампли­ фикация ДНК для целенаправленного модифицирования имею­ щихся клеточных линий с помощью метода РНК-интерференции.

Затем для культивирования клеток в производственных условиях проводится подбор и оптимизация сред для культивирования.

Н еобходим ы м условием создания пром ы ш ленной клеточной линии является ее стабильность, поэтому после перевода культуры клеток в суспензионное состояние и адаптации к условиям роста стабильность продукции и пролиферации на протяжении 100- клеточных удвоений. На основе наиболее оптимального клона, удовлетворяющего всем требованиям промышленной продукции, получают производственную линию клеток-продуцентов реком­ бинантного белка. Л аборатория для культивирования клетокпродуцентов создается в соответствии с регламентом GMP для чистых помещений: отдельная система вентиляции кондициони­ рованным и фильтрованны м воздухом, обеспечиваю щ ая 10-ти кратный обмен воздуха; давление внутри клеточного блока всегда несколько выше, чем давление в остальных помещениях. Эти лабо­ ратории оснащ ены ламинарами, С 0 2 - инкубаторами, флуорес­ центными и световыми микроскопами, микро- и препаративными центрифугами, цитофлюриметрами для оценки пролиферирующей активности клеток, анализа клеточного цикла и др. Клетки куль­ тивируются в 5-10-литровых ферментерах, в ряде случаев приме­ няются одноразовые мини-биореакторы (рис.36).

млекопитающих in vitro есть и некоторые проблемы, связанные с вы сокой себ е с то и м о с ть ю к о н ечн о го пр о д у кта; связан н ы е с нередкой мутацией производственной линии клеток-продуцентов.

Генно-инженерные технологии создания трансгенных живот­ ных осуществляются ex vivo:

5.7. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в клетках млекопитающих Рис.36. Одноразовый биореактор, емкостью 50 мл Он оснащен вентилируемой крышкой с резьбой с пятью отверстиями различного диаметра для оптимального обмена газов с окружающей атмосферой; полупроницаемая мембрана на этих отверстиях является барьером для сохранения стерильности в биореакторе и уменьшает потери жидкости вследствие испарения. Внутри биореактора не установлено никаких перемешивающих устройств или механизмов, массоперенос осуществляется за счет встряхивания в соответствующем инкубацинном шейкере (в котором можно регулировать температуру, парциальное давление углекислого газа и влажность, а также скорость и амплитуду встряхивания). Маленькие размеры биореактора позволяют проводить параллельное использование сотен подобных устройств при культивировании клеток - продуцентов рекомбинантного белка.

а) микроинъекции клонируемого ДНК вместе с регуляторным элементом (промотором) в ядро оплодотворенной яйцеклетки животного. Затем яйцеклетка инокулируется в матку суррогатной матери. Новорожденное животное тестируется на наличие транс­ фицированного гена и по достижении им половой зрелости скре­ щивается с обычными животными. Однако метод микроинъекций ДНК оказался недостаточно эффективным; трансгенные эмбрио­ ны развивались до жизнеспособного плода лишь в 1-5% случаев.

б) клонирование путем замены ядра яйцеклетки ядром сома­ тический клетки. Таким образом, новорожденное животное гарантированно становилось носителем нужного гена. Именно такой технологией была клонирована овечка Долли.

Продуцентами рекомбинантных белков могут быть транс­ генные козы, крупный рогатый скот, кролики, мыши, домашние птицы и другие животные.

Это препараты для лечения гемофилии, ангионевротического отека, дефицита альфа-1 антитрипсина и других заболеваний, связанных с недостаточностью какого-либо белка.

Для большей части подобных болезней мировая потребность в соответствующем белке может быть удовлетворена одним

5. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА

стадом из 50 коров или 100 коз. Например, из молока одной трансгенной козы, можно выделить столько же рекомбинантного человеческого белка-антитромбина III (применяется как фибринолитический препарат), сколько из 90 тыс. донорских доз крови (рис.37).

Рис.37. Трансгенные козы продуценты рекомбинантного белка тений, пыльца которых легко раз­ ными генами, козы не могут быть источником бесконтрольного распространения генетического материала.

Генно-модифицированные бактерии и трансгенные животные являются носителями чужеродного гена (трансгена). На нем происходит синтез или сборка необходимого белка, затем данный протеин выделяется в клетку бактерии или околоклеточное пространство (при микробном синтезе) или молочную железу (в случае животного-продуцента). Далее белок адсорбируется из жидкости и очищается, а трансфицированный ген остается в бактериальной клетке или организме животного. Таким образом, в чистом полученном продукте трансген отсутствует. Микро­ организмы-продуценты или животные-продуценты - лишь промежуточное звено от гена к белку.

Наряду с гормонами, цитокинами и другими биологически активными соединениями, модифицированные штаммы микро­ организмов с эукариотной организацией клетки могут приме­ няться для синтеза альбумина, сверхпрочного биологического материала и прочее:

- технология получения рекомбинантного альбумина человека с использованием микроорганизмов-эукариот. Так, получен высокопродуктивный штамм дрожжей Pichia pectoris, дающий 5.7. Рекомбинантные белки, экспрессируемые в клетках млекопитающих выход рекомбинантных белков на порядок выше в сравнении с широко используемой кишечной палочкой, что резко снижает себестоимость эукариотических рекомбинантных белков. Раз­ работан штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирую­ щий интерлейкин-2;

- искусственные белки паутины для медицины. Каркасная ни паутины, необычайно прочная и эластичная, состоит из двух белков: спидроина-1 и спидроина-2; эти белки могут быть исполь­ зованы в медицине в качестве шовного материала, искусственных связок и сухожилий, пленок для покрытия и заживления ран и ожогов. Синтезирован ген, кодирующий спидроин-1 в составе плазмидного вектора, встроенного в P ich ia p a s to r is. Реком­ бинантный микроорганизм продуцирует белок спиндроин-1.

Получена нить толщиной в несколько микрон, по прочности крепче кости и сухожилий. Выполняются исследования над син­ тезом гена, кодирующего белок спиндроин-2 (рис.38).

Рис.38. Фотография искусственной нити, полученной на основе выделенного из клеток дрожжей рекомбинантного белка — аналога белка каркасной нити паутины (в сосуде с этанолом), (С сайта www.sciam.ni//2005/7/img/nit.jpg)

6. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА

В ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКЕ

С. Мильштейном и Н. Ерне,разработана гибридомная технология;

- 1987 г., 3. Тонегава, за исследование соматической рекомбинации гено иммуноглобулинов как основы формирования разнообразия антигенраспознающих рецепторов лимфоцитов.

6.1. Характеристика антител История открытия антител начинается с золотой эры микро­ биологии, с периода открытия многих возбудителей инфекцион­ ных болезней, когда врачи и ученые пытались найти лекарственные средства избирательно поражающие патогены, не нанося вреда клеткам макроорганизма. Врач и бактериолог П. Эрлих посвятил свою жизнь поиску лекарств, химиопрепаратов, которые целе­ направленно поражали бы патоген как «магическая пуля», что позволяло бы воздействовать только на очаг болезни, не повреж­ дая здоровые ткани. В результате многочисленных исследований ему удалось найти эф ф ективное для того врем ени средствохимиопрепарат, который поражал возбудитель сифилиса - блед­ ную трепонему.

В результате изучения механизмов иммунитета в сыворотке переболевших той или иной инфекцией были выявлены вещества, которые избирательно связывались с возбудителем. Эти белковые соединения были названы антителами. Терапевтическое примене­ ние антител началось в 18 9 1 году, сразу же после того, как Беринг 6.1. Характеристика антител и Китазато показали, что сыворотка морских свинок, выживших после введения дифтерийного или столбнячного токсинов, приобретала способность защищать других животных от действия этих токсинов.

В организме каждый клон В-лимфоцитов продуцирует один вид антител, а различный спектр клонов В-лимофоцитов формируется за счет перераспределения сегментов вариабельных генов антител (V-генов). После презентации антигена В-лимфоциты дифферен­ цируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела и в долгоживущие клетки памяти. Далее при повторной иммунизации происходит повышение аффинности антиген-специфичных кло­ нов антител, связанное с изменениями в V-генах, а также про­ дукцией новых преадаптированных клонов В-лимфоцитов.



Pages:     | 1 |   ...   | 16 | 17 || 19 | 20 |   ...   | 35 |
 


Похожие работы:

«ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ ДИСТАНЦИОННОГО ОБРАЗОВАНИЯ И ТЕХНОЛОГИЙ А. В. Поддубный Экологические проблемы и устойчивое развитие регионов ВЛАДИВОСТОК 2002 г. РАБОЧАЯ УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА МОДУЛЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРОБЛЕМАТИКУ 1.1. Классификация экологических проблем, ее условность 1.2. Глобальные социально-экологические проблемы 1.2.1. Проблемы охраны недр, обеспечения сырьем и экологические проблемы, возникающие в процессе добычи полезных ископаемых. 10 1.2.2 Комплекс проблем, связанных с охраной подземных...»

«Г. С. СКОБЛИН ЛУГОВОЕ И ПОЛЕВОЕ КОРМОПРОИЗВОДСТВО Допущено Главным управлением высшего и средне­ го сельскохозяйственного образования Министерства сельского хозяйства СССР в качестве учебного по­ собия для средних сельскохозяйственных учебных заведений Ф МОСКВА К О Л О С 1977 633.2 С44 У Д К 633.2/.4(075.3) Скоблин Г. С. С 44 Л уговое и полевое кормопроизводство. М., Ко­ лос, 1977. 256 с. с ил. (Учебники и учеб. пособия для сред. с.-х. учеб. заведений)., ОПИСАНО В пособии рассм атриваю тся...»

«Государственный комитет по лесному хозяйству Республики Тыва ЛЕСОХОЗЯЙСТВЕННЫ Й РЕГЛАМЕНТ ГКУ РТ КАА-ХЕМСКОЕ ЛЕСНИЧЕСТВО Исполнитель: Общество с ограниченной ответственностью Научно – Проектный Центр Инженерно-Изыскательских Работ Генеральный директор Попов П. И. Воронеж, 2011 г. Оглавление Введение.. 6 Глава 1 Общие сведения.. 13 Краткая характеристика.. 1.1 13 Наименование и местоположение лесничества. 1.1.1 13 Общая площадь лесничества и участковых лесничеств.. 1.1.2 14 Распределение...»

«ЭНТОМОЛОГИЧЕСКИЕ И ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПОВОЛЖЬЕ ЭНТОМОЛОГИЧЕСКИЕ И ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПОВОЛЖЬЕ Chernyshevsky Saratov State University Saratov Department of Russian Entomological Society Saratov Department of Russian Parasitologic Society ENTOMOLOGICAL AND PARASITOLOGICAL INVESTIGATIONS IN VOLGA REGION Collected proceedings Number 9 Editor prof. V.V. Anikin and prof. N.V. Popov SARATOV SARATOV UNIVERSITY PRESS 2011 Саратовский государственный университет им. Н. Г....»

«МИР ПРИРОДЫ В МИРЕ ИГР ОПЫТ ФОРМИРОВАНИЯ ОТНОШЕНИЯ К ПРИРОДЕ Мир природы в мире игр: опыт формирования отношения к природе. /Экологопросветительский центр Заповедники. В.А. Ясвин. – М., 1998. – 40 с. Праздность дети, как правило, ненавидят. Вы должны превращать для них необходимые, по вашему мнению, занятия в развлечение, а не делать из них обязательную работу. Джон Локк.Мысли о воспитании, 1693 г Посвящается Маргаритке и Янке От автора В этой небольшой книжке представлен десятилетний опыт...»

«Поделенная белорусско Цель проекта состоит в созда польской границей Беловежская нии условий для устойчивого ра пуща представляет собой оста звития региона Беловежской пу ток огромного древнего лесного щи на основе совмещения охра массива, некогда простиравше ны природы и экологического гося от берегов Балтики до Буга туризма. и от Одера до Днепра. Богатство Кроме Беловежской пущи, на и уникальность биологического территории проектного региона разнообразия Беловежской пу расположено еще...»

«Яранск...»

«ОГЛАВЛЕНИЕ • ЧАСТЬ 1. ФИЛОСОФИЯ. 1 Системный подход к анализу общества. Основные сферы общественной жизни 1.1 и их взаимосвязь Общество и природа 1.2 Проблема периодизации исторического процесса. Исторические типы 1.3 общества. 15 Общественный прогресс и его критерии. Противоречивость и формы 1.4 прогресса 26 Глобализация и глобальные проблемы человечества. Социальные последствия 1.5 НТР 33 Человек как продукт биологической, социальной и культурной эволюции. 1.6 Соотношение понятий человек,...»

«Так называемый сложный микроскоп изобрели приблизительно в 1609 году независимо друг от друга Захария Янссен (ок. 1588— ок. 1631) и Галилео Галилей (1564—1642) [367]. Роберт Гук (1635— 1703), по отзывам современников, человек не только выдающегося таланта изобретателя, но и незаурядных добродетелей [459, 3 p. 295], при помощи этого микроскопа обнаружил в куске коры пробкового дерева мельчайшие заполненные воздухом полости, которые и на­ звал клетками. Он еще раз использовал это слово в своем...»

«Байметов К.И., Турдиева М.К., Ражаметов Ш.Н. ОСОБЕННОСТИ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ МЕСТНЫХ СОРТОВ АБРИКОСА В УЗБЕКИСТАНЕ ТАШКЕНТ 2010 В данной публикации изложены результаты регионального проекта In situ/On farm сохранение и использование агробиоразнообразия (плодовые культуры и их дикие сородичи) в Центральной Азии. Проект осуществляется в пяти странах – Казахстан, Кыргызстан, Таджикистан, Туркменистан, Узбекистан и координируется Bioversity International при финансовой поддержке Глобального Экологического...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.