WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 35 |

«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

-- [ Страница 16 ] --
Рис.30. Схема синтеза препроинсулина в прокаритной клетке П оэтому технология получения генно-инженерного инсулина в клетках E.coli была принципиально изменена. Предварительно химическим путем раздельно синтезирую тся две нуклеотидные последовательности - кДНК, кодирующие А цепь и В цепь. Затем их встраивают раздельно в две векторные плазмиды, последние трансформируют в два различных штамма Е. coli. В этих фраг­ ментах кДНК нет нуклеотидных последовательностей, кодирую­ щих сигнальные (Сп) и соединительные (С) пептиды. Генетически выделяют из культуральной жидкости рекомбинантные белки А и В цепи инсулина, их соединяют химическим путем дисульфидными связями, получают чистый, биологически активный инсулин.

Одноцепочечные олигонуклеотиды, короткие фрагменты ДНК, кодирующие А и В цепи инсулина получают химическим синтезом при помощи ДНК-синтезатора (рис.31). Это аппарат, состоящий из системы клапанов и насосов, позволяющих в реакционную смесь по строго заданной программе вводить нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи нуклеотидов. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединить к 5-штрих гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке с компьютерным программным сопровождением.

Технология получения реком би н ан т н ого инсулина включйегп следующ ие стадии:

- химический синтез ДНК последовательностей, кодирую11111* продукцию А и В цепей;

5.2. Инсулин, технологии получения - эти последовательности нуклеотидов встраиваются в lacZ ген E.coli, кодирующий часть молекулы фермента бета-галактозидазы, lacZ ген находится в составе pBR322 плазмиды;

- каждую из плазмид с lacZ геном и А (или В) цепью вводят в отдельный штамм Е. coli;

- штаммы-продуценты культивируют раздельно в двух био­ реакторах, трансформированные E.coli продуцируют химерные белки, состоящие из ковалентно связанных молекул рекомбинант­ ного белка (А или В-цепи) и собственного белка эшерихий;

- выделив химерные белки, их обрабатывают бромцианом, разъединяющим белки по остаткам метионина. Далее А и В цепи отделяются от белков фермента бета-галактозидазы и очищаются;

- очищенные А и В цепи соединяются дисульфидными связями, получают двухцепочечный, биологически активный мономер инсулина.

5.3. Человеческий гормон роста, технологии получения Человеческий гормон роста (чГР) продуцируется гипофизом и регулирует рост организма. Его недостаточность является причиной карликовости (рис.32) и остеопороза, приводящего к частым переломам костей (известен случай —67-летний карлик на протяжении жизни 17 раз ломал руки и ноги). Назначение чГР предотвращ ает карликовость у молодых, укрепляет кости у пожилых карликов.

Гормон видоспецифичен, поэтому для лечения карликовости использовали гормон роста, выделенный из гипофиза умерших людей. Гипофиз содержит около 4 мг этого пептида, ребенку на недельный курс необходимо 7мг, лечение продолжается несколько лет. Кроме того, наличие определенной гетерогенности пептидов, выделенных из разных гипофизов в ряде случаев приводило к выработке против этих пептидов антител в организме больного, получавшего препарат.

Технология получения рекомбинантного чГР разработана в 1979 году. Ген, кодирующий синтез гормона был сконструирован посредством комбинации химического и биологического синтеза.

Участок гена, кодирующий первые 24 аминокислоты пептида, был

5. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА

химически синтезирован из отдельны х нуклеотидов. О стальная часть гена получена биосинтезом. Для этого с помощ ью фермента гипоф изарной ткани человека, бы ла син тези рован а копия гена гормона роста. Затем нужный фрагмент был выделен сайтспециф и ч е с к и м и р е с т р и к ц и о н н ы м и н у к л е а за м и и п р и с о ед и н е н с помощью ДНК-лигазы к синтетическому фрагменту из 24 амино­ кислот.

Сконструированный совместным химическим и биологическим синтезом ген горм она роста встраивается в модифицированную плазмиду pBR322, несущую lac-оперон. П лазмида pBR322 транс­ собственным инициирующим кодоном (АТЦ), т.е. группой из трех нуклеотидов, служащ ей сигналом начала транскрипции. Поэтому горм он м ог п род уци роваться м и кр о о р ган и зм ам и не в составе какого-либо микробного белка, а самостоятельно.

Применение генно-инженерной технологии позволило избежать побочного эффекта, связанного с рецепцией гормона. Нативный 5.3. Человеческий гормон роста, технологии получения чГР связывается в разных типах клеток организма, как с располо­ женными на их поверхности рецепторами гормона роста, так и с пролактиновым рецептором. Чтобы исключить ненужное связы­ вание гормона с пролактиновым рецептором при помощи сайтспецифического мутагенеза, внесены изменения в боковые группы некоторых аминокислот-лигандов для ионов Zn++, необходимых для высокоаффинного связывания чГР с пролактиновым рецеп­ тором. В результате получен модифицированный гормон роста человека, связывающийся только со «своим» рецептором.

В процессе ферментации рекомбинантной культуры кишечной палочки, благодаря активной экспрессии гена чГР в составе трансформированной плазмиды, в генетически модифицированной микробной клетке начинается биосинтез гормона роста, состоя­ щего из 191 аминокислоты. Накапливается последний в периплазматическом пространстве. Клеточная стенка E.coli разрушается, высвобождая чГР в окружающее пространство. Цитоплазматичесi кая мембрана остается интактной, сводя к минимуму возможное загрязнение препарата внутриклеточными белками бактерии.

Затем чГР экстрагируется с последующей очисткой до гомоген­ ного состояния. Учитывая технологические стрессы, воздей­ ствующие на рекомбинантный штамм в процессе ферментации, ? периодически анализируется стабильность плазмиды в составе E.coli К12.

5.4. Интерфероны Цитокины Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных сил организма. К общим свойствам цитокинов, объединяющим их в самостоятельную систему регуляции, относятся:

- плейотропизм (полифункциональность) и взаимозаменяемость биологического действия, - индуцибельный характер синтеза, - отсутствие антигенной специфичности действия, - саморегуляция продукции и формирование цитокиновой сети, в которой отдельные цитокины обладают синергическим или антагонистическим действием.

В отличие от гормонов большинство цитокинов являются молекулами локального (паракринного) действия. Они продуцируются и утилизируются клетками, находящимися в тесной близости. Возможно и аутокринное действие цитокинов, т.е.

действие на ту же клетку, которая секретировала данный цитокин. После выделения клетками-продуцентам и цитокины имеют короткий период полувыведения из кровотока. До 50% циркулирующих цитокинов интернализуется в течение 30 минут.

Основными клетками-продуцентами цитокинов иммунной системы являются Tхелперы и макрофаги; цитокины - факторы роста продуцируются фибробластами, эндотелиальными клетками, макрофагами, лимфоцитами и лейкоцитами. Известно более 200 индувидуальных соединений, относящихся к семейству цитокинов.

Наиболее хорошо изучены факторы роста и цитокины иммунной систем.

В клинической практике существуют три основных направления применения цитокинов:

- цитокиновая иммунотерапия, при которой цитокины выступают в роли лекарственных средств, - антицитокиновая терапия, направленная на блокирование биологического действия или удаление избытка цитокинов из организма, - цитокиновая генотерапия, применяемая с целью усиления противоопухолевого иммунитета, коррекции дефектов в системе цитокинов и их рецепторов.

Среди цитокинов наиболее часто применяются и налажено широкомасштабное биотехнологическое производство рекомбинантных интерферонов, интерлейкинов, эритропоэтина.

В 1957 году учеными было показано, что лабораторные мыши, переболевшие гриппом, не подвержены инфекции другими, более опасными вирусами. П оследую щ ие исследования показали, что клетки животны х и человека в ответ на вирусную инфекцию выделяют белковое со ед и н ен и е, защ ищ аю щ ее не зараженны е клетки от вирусной инвазии. Это вещество было названо интер­ фероном. Интерфероны - это группа глобулярных белков, относя­ щихся к трем классам: альфа, бета и гамма. Интерфероны - альфа и бета вырабатываются во всех клетках организма человека, в отличие от гамма-интерферона, который синтезируется в Т-лимфоцитах и N K -клетках. Интерферон-гамма имеет меньшую проти­ вовирусную активность, но выполняет более важные иммунорегуляторные функции. Интерфероны проявляют свое действие, связы ваясь со специф ически м и рецепторам и на поверхности клеток, что в свою очередь ведет к синтезу клетками около протеи н ов, благодаря которым и реализуется би ол оги ч еск ое действие интерферонов, а именно: противовирусный, противомикробны й, противоопухолевы й, иммуномодулирую щ ий эффекты.

Противовирусное действие интерферонов обусловлено, главным образом, индукцией синтеза двух ферментов в клетках : 2*5’олигоаденилатциклазы и протеинкиназы (рис.33). Оба фермента проявляю т свою активность в присутствии двухц еп оч еч н ы х вирусных ДН К, образую щ и хся в клетках при репродукции вирусов. Активация этих ферментов ингибирует биосинтез белка и размножение вирусов в инфицированных ими клетках организма путем деградации вирусных иРНК и рРНК; клетки, зараженные вирусами вследствие этого лизируются. Интерфероны видоспе­ цифичны, т.е. человеческий интерферон биологически активен в организме человека, мышиный - в организме этого животного и т.д. В лейкоцитах синтезируется преинтерферон, состоящий из 187 аминокислотных остатков. Затем ферментативно отщепляется сигнальный пептид (21 аминокислотный остаток) и образуется интерферон, размером в 166 аминокислотных остатков. Интер­ ферон лейкоцитарный можно получать из донорской крови: из одного литра крови выделяют 1 мкг альфа-интерферона, т.е. одну рнбосомной РНК

5. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА

дозу для инъекции. Разработана технология химического синтеза молекул интерферона.

Технология получения рекомбинантного интерферона Гены лейкоцитарного интерферона встраиваются в плазмидный вектор pBR322 E.coli (рис.34). В составе плазмиды есть промотор, инициирующий репликацию последовательности —точка ori; есть терминирую щ ий кодон, регулирую щ ий окон чан ие синтеза молекулы интерферона.

С целью усиления антивирусной и противоопухолевой актив­ ности цитокина созданы плазмидные векторы, одновременно несущие гены синтеза нескольких интерферонов (альфа 1, альфа и др). Гибридные интерфероны индуцировали образование в клет­ ках 2,-5’-олигоизоаденилатсинтетазы. Этот фермент участвует в синтезе 2 ’-5 ’-связанны х олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщ епляю щ ую вирусную мРНК. Н екоторы е гибридные интерфероны проявляли выраженную антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека в эксперименте, отмечена их иммуномодулирующая способность.

При культивировании рекомбинантного штамма E.coli экспрес­ сируются гены, ответственные за синтез интерферона; трансфор­ мированные гены интерферона не содержат интронов; получен­ ный рекомбинантный интерферон биологически активен. Концен­ трация интерферона достигает 5 мг/л культуральной жидкости.



Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 35 |
 


Похожие работы:

«НАСТАВЛЕНИЯ ПО НАДЗОРУ, УЧЁТУ И ПРОГНОЗУ ХВОЕ- И ЛИСТОГРЫЗУЩИХ НАСЕКОМЫХ В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РСФСР Москва – 1988 Наставление разработано на кафедре Промышленной экология и защиты леса МЛТИ, Руководитель д.б.н., проф. А.И. Воронцов, ответственный исполнитель к.б.н., ст.н.сотр, А.В. Голубев. Б работе принимали участие д.б.н., проф. В.Г. Мозолевская, к.б.н. ст. научн. сотр. Н.К. Белова и к.б.н., доцент Н.Г. Николаевская. ОГЛАВЛЕНИЕ ЛЕСОПАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР Общие положения Рекогносцировочный...»

«В.А.Бароненко, Л.А.Рапопорт Здоровье и физическая культура студента Допущено Министерством образования Российской организации в качестве учебного пособия для студентов учреждений среднего профессионального образования, обучающихся по группе специальностей 0300 Образование Научный редактор В.А.Бароненко Рецензенты: доктор биол. наук, академик РАН В.Н.Большаков доктор биол. наук, академик РАЕН и МАНЭБ Б.Г. Юшков Москва 2003 Альфа-М АННОТАЦИЯ Авторами учебника являются известные специалисты по...»

«СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ: МЕТОДЫ Под редакцией А. ЛЕЙСИ Перевод с английского д-ра биол. наук И. А. ВОРОБЬЕВА Москва Мир 1992 Авторы: Брэдбери С. Дж., Эвеннет П. Дж., Хоробин Р. В.„ Имре С. Ф., Лейси А., Мейл В., Ормерод М. Г., Плозм И. С., Самнер А. Т., Вейс Д. Г., Уик Р. А. Световая микроскопия в биологии. Методы: Пер. с англ./Под ред. А. Лейси.—М.: Мир, 1992. — 464 с. Руководство по использованию современных методов световой микроскопии, написанное международным коллективом авторов...»

«Каталог № 3.2004 Обращаем Ваше внимание на то, что Каталог № 3.2004 действителен с 29 сентября 2004 г. (с изменениями на 4 ноября). На все поставляемое оборудование дается гарантия 1 год с даты поставки и обеспечивается послегарантийное техническое обслуживание. Остаточные сроки годности иммуноферментных тест-систем - не менее 6 месяцев при поставке по контракту, не менее 4 месяцев при поставке со склада; при поставке со склада сроки годности остальных реагентов - не менее 4 месяцев,...»

«ЛЕСНОЙ КОДЕКС РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Принят Государственной Думой 8 ноября 2006 года Одобрен Советом Федерации 24 ноября 2006 года (в ред. Федеральных законов от 13.05.2008 N 66-ФЗ, от 22.07.2008 N 141-ФЗ, от 22.07.2008 N 143-ФЗ, от 23.07.2008 N 160-ФЗ, от 25.12.2008 N 281-ФЗ, от 14.03.2009 N 32-ФЗ, от 17.07.2009 N 164-ФЗ, от 24.07.2009 N 209-ФЗ, от 27.12.2009 N 365-ФЗ, от 22.07.2010 N 167-ФЗ, от 29.12.2010 N 442-ФЗ, от 14.06.2011 N 137-ФЗ, от 01.07.2011 N 169-ФЗ, от 11.07.2011 N 200-ФЗ, от...»

«Фокин В.В. К ЗЕМЛЕ С НАУКОЙ. Данная Брошюра - результат научных разработок инженера - изобретателя Фокина В. В., автора необычного огородного инструмента - ручного плоскореза, который обрабатывает почву без оборота пласта, т е. с минимальным вмешательством во внутренний мир почвы. Брошюра рассказывает о том, как “мирное сосуществование” земледельца и обитателей почвы позволяет выращивать хорошие урожаи “без боли в пояснице и мозолей на руках”. Перепечатка брошюры, а также изготовление ручных...»

«Конец мусорной цивилизации: пути решения проблемы отходов. Издание подготовлено при поддержке Представительства общества Оксфам в РФ Конец мусорной цивилизации: пути решения проблемы отходов. Автор - Сапожникова Галина Павловна, кандидат биологических наук, член правления АОН Семейный центр Три поколения Редактор – Новицкий С.Л. Техническая помощь в подготовке материалов – Ахметов Л. Автор рассматривает проблему сбора, хранения и переработки мусора, описывает весь спектр проблем, анализирует...»

«Е.А. Бураева, В.С. Малышевский ЗАНИМАТЕЛЬНАЯ РАДИОЭКОЛОГИЯ Пособие для школьников Ростов-на-Дону 2013 Е.А. Бураева, В.С. Малышевский. Занимательная радио­эко­ло­гия: по­со­бие для шко­льнико­в. // Ро­сто­в-на-До­ну. По­со­бие Занимательная радио­эко­ло­гия предназначено­ для учащихся старших классо­в средних о­бразо­вательных учреждений и со­держит о­писание лабо­рато­рных рабо­т по­ Радио­эко­ло­гии и радиацио­нно­му ко­нтро­лю террито­рий и о­бъекто­в для со­вместно­го­ выпо­лнения с...»

«УТВЕРЖДАЮ Руководитель ООП подготовки Магистров А.Г. Емельянов 2012 г. Учебно-методический комплекс по дисциплине Методы региональных геоэкологических исследований, 1 курс (наименование дисциплины, курс) 022000.68 Экология и природопользование (шифр, название направления подготовки) Геоэкология (название специализированной программы подготовки магистров) Обсуждено на заседании кафедры Составитель: физической географии и экологии к.г.н., доцент А.А. Цыганов 25 апреля 2012 г. Протокол № 4 Зав....»

«Сингулярность действительно близко Адаптация и интерпретация труда Raymond Kurzweil “Singularity is near” Марк Ромул 2013 2 The Singularity is near – творение Рэймонда Курцвейла, благодаря которому многим станет понятно куда движется наша человеко-машинная цивилизация в целом и что нас ждет в ближайшем будущем. Об этом можно говорить часами, но лучше посмотрите что об этом думают сильные мира сего: Рэй Курцвейл дает самые точные прогнозы искусственного интеллекта и будущего в широком смысле, из...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.