WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 13 | 14 || 16 | 17 |   ...   | 35 |

«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

-- [ Страница 15 ] --

Существенными темпами растет мировое производство новых рекомбинантных белковых препаратов: вакцины, иммуностимуля­ торы, факторы свертывания крови, гранулоцитарный колоние­ стимулирующий фактор, интерфероны и др. Высокая специфич­ ность действия, фармакологическая активность, незначительность возможных побочных действий, чистота от посторонних биологи­ чески активных веществ, относительно низкая себестоимость определяют перспективность дальнейшего развития биотехно­ логического производства человеческих белков в клетках микро­ организмов, растений и животных.

Рекомбинантные человеческие белки - это белки, ДНК которых конструирована in vitro путем встраивания генов, кодирующих

% 5. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА

белок человека в геном м икроорганизм ов, клеток растений и млекопитающих. С этой целью вначале трансформируемый фраг­ мент ДНК обрабатывается эндонуклеазой рестрикции. В резуль­ тате об разу ется Д Н К с «липким и ко н ц ам и », которая м ож ет соединяться с любой молекулой ДНК, имеющей комплементарные липкие концы. ДНК-лигаза ковалентно связывает две нити в одну молекула ДНК встраивается в вектор (на основе вирусов либо плазм ид) и последний тр ан сф и ц и руется в клетку-п родуц ен т реком бинан тн ого белка (клетки м икроорган изм ов, растений, млекопитающих). Для экспрессии рекомбинантного белка в вектор вводятся промотор, сайт связывания с рибосомой и терминатор, а также меркерный ген, обеспечивающий селекцию и идентифи­ кацию клеток, продуцирую щ их р еком бинан тн ы й белок. При клонировании в клетках прокариот гены человека не должны содержать нитроны, поскольку бактерии не распознают их и это может стать причиной преждевременной терминации, и синтез или сборка белка могут быть нарушены.

В случае встраивания генов человека в векторную систему на основе бактериофага и трансфекции последней в клетки E.coli, то обеспечивается внеклеточное накопление рекомбинантного белка, непосредственно в культуральной среде, в активной растворимой форме. Это происходит потом у, что вследствие репродукции вируса бактериальная клетка разруш ается и реком бинантны й белок оказывается во внеклеточной среде.

Если в качестве вектора используется плазмида, то экспресси­ руемый рекомбинантны й белок может остаться внутри клеток микроорганизмов. Тогда необходимо не только разрушать клетки для извлечения целевого продукта, но и переводить белок в активную растворимую форму, последовательно используя методы ден атурац ии и ренатурации целевого белка. Эти процедуры приводят к значительным потерям целевого продукта, а в процессе ренатурации могут образовываться молекулы рекомбинантного белка с неправильной конформацией, от которых очень сложно избавиться в процессе очистки препарата.

Наряду с технологией де- и ренатурации при выделении реком­ бинантного белка из клетки или из внеклеточной среды, испольРекомбинантные белки зуется технология аффинной хроматографии на основе хелатных комплексов кобальта или ионов никеля, которые иммобилизованы ковалетной связью на частицах полистирольной основы. Ионы кобальта или никеля с повышенной селективностью образуют координационные связи с гистидиновыми группами рекомбинант­ ного белка (рис. 29). Рекомбинантные, как и иные белки содержат шесть и более идентичных гистидиновых остатков, которые действуют как сайты связывания металлов; эти сайты используются при очистке белка и экспрессии. Последовательность hexa-His называют His-концом, который может быть помещен на N-конец белка-мишени. His-конец содержит сайт расщепления для специ­ фических протеаз. Рекомбинантные белки с His-концом очи­ щаются методом металло-хелат аффинной хроматографии на нике­ левых или кобальтовых ионных колонках методом элюирования из металл-хелатной колонки с помощью гистидина или имидазола.

Затем очищенный белок с His-концом обрабатывают с помощью специфической протеазы для отщепления H is-конца, или не обрабатывают, если His-конец не влияет на активнй сайт белка.

Рис.29. Схема образования ионами металлов координационных связей Если продуцентами рекомбинантного белка являются моди­ фицированные штаммы микроорганизмов, то последние культи­ вируются в биореакторе; при использовании трансгенных расте­ ний рекомбинантный белок накапливается в листьях, в плодах, в корне; у трансгенных животных обычно «биореактором» является молочная железа, с молоком которой выделяются рекомбинантные белки.

5. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ ЧЕЛОВЕКА

млекопитающих in vitro применяется редко из-за определенных методических сложностей и пока не высокой рентабельности. Так, все линии культур клеток ж ивотны х, используем ы х для этих процессов, должны иметь индивидуальные характеристики. Более того разны е стадии п р о и зво дства белка требую т различны х условий процесса. П оэтому отработка технологического про­ цесса, создание клеточных линий - продуцентов рекомбинантного белка и оптимизация питательных сред являются особенно важ­ ными для обеспечения м аксим ального вы хода качественного конечного продукта (белка). Вместе с тем, получение рекомби­ нантных белков в суспензии культур клеток - это перспективное направление развития биотехнологического производства.

В зависимости от биологического действия рекомбинантные терапевтические белки подразделяются на следующие группы:

- гормоны (инсулин, соматотропин и др.);

- цитокины (интерф ероны, ин терлейкины, ф акторы роста клеток костного м озга - колониестим улирую щ ие ф акторы и эритропоэтин, факторы некроза опухолей и др.);

- факторы сверты вания крови (реком бинантны й активатор тканевого плазминогена - rt РА; рекомбинантны й VIII фактор свертывания крови; рекомбинантный активированный VII фактор свертывания или проконвертин - rVIIa и др.);

- ферменты (рекомбинантная проурокиназа, рекомбинантная альфа-ДНК-аза и др.);

- вакцины (против вирусного гепатита В, вакцина против ротавирусной инфекции и др.);

- и другие рекомбинантные белковые препараты.

Близки к рекомбинантным белкам по технологии получения химерные и гуманизированные моноклональные антитела.

5.2. Инсулин, технологии получения В 1869 году в Берлине 22-летний студент-медик П. Лангерганс изучая с помощью микроскопа строение поджелудочной железы, обратил внимание на ранее не известные клетки, образующие группы, которые были равномерно распределены по всей железе, в последующем они были названы «островки Лангерганса». В 1901 году было показано, что сахарный диабет обусловлен разрушением этих «островков» в поджелудочной железе.

До начала 20-х годов XX века у молодых людей с сахарным диабетом, т.е.

нуждающихся в инсулине, не было никаких шансов прожить долго. Осенью года в г.Торонто (Канада) врачи Ф.Бантинг и Ч.Бест выделили некое вещество из поджелудочной железы телят, которое снижало уровень сахара крови у собак с экспериментальным диабетом. И января 1922 года, после множества успешных испытаний на собаках, страдающему диабетом 14-летнему мальчику была сделана первая в истории инъекция инсулина. Впоследствии они получили Нобелевскую премию, а день рождения Бантинга в настоящее время отмечается как Международный день диабета (14 ноября).

Инсулин синтезируется клетками Лангерганса в поджелудоч­ ной железе, гормон регулирует углеводный обмен в организме, обеспечивает усвоение глюкозы клетками, его недостаток при­ водит к сахарному диабету. Первичная структура или точная последовательность расположения аминокислот, образующих молекулу инсулина впервые определена Ф. Сенгером. В после­ дующем Д.Ходжкин с помощью метода рентгеновской дифракции определила пространственное строение молекулы инсулина (вторичную — четвертичную структуры).

Первые препараты инсулина были животного происхождения.

С 1922 года свиной и бычий инсулин применялся как лечебный препарат при диабете. Технология заключалась в экстрагировании белка- инсулина из поджелудочной железы (100 грамм кристал­ лического инсулина из 800-1000 кг поджелудочной железы).

В процессе синтеза белково-пептидных гормонов в клетках эндокринных желез вначале происходит образование полипептида, не обладающего гормональной актив­ ностью. Полипептид в своем составе имеет фрагменты, содержащие аминокислотную последовательность соответствующего гормона. Такая белковая молекула называется пре-про-гормоном и имеет в своем составе (обычно на N-конце) структуру, которая называется лидерной или сигнальной последовательностью (пре-). Эта структура пред­ ставлена гидрофобными радикалами и нужна для прохождения этой молекулы от рибосом через липидные слои мембран внутрь цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭПР). При этом, во время перехода молекулы через мембрану в результате ограниченного протеолиза лидерная (пре-) последовательность отщепляется и внутри ЭПР оказывается прогормон. Затем через систему ЭПР прогормон транспортируется в комплекс Гольджи и здесь заканчивается созревание гормона.

Вновь в результате гидролиза под действием специфических протеиназ отщепляется оставшийся (N-концевой) фрагмент (про-участок). Образованная молекула гормона, обладающая специфической биологической активностью поступает в секреторные пузырьки и накапливается до момента секреции в железе.

Синтез инсулина в поджелудочной железе происходит следую­ щим образом. В клетках Лангерганса на рибосомах ЭПР синтези­ руется пептид-предшественник -препроинсулин. Он представляет собой полипептидную цепь, построенную из 110 аминокислотных остатков и включает в себя расположенные последовательно: Сппептид, А -пептид, С-пептид и В-пептид. Почти сразу же после синтеза в ЭПР от этой молекулы отщепляется сигнальный (Сп) необходим ы для прохож дения синтезируем ой молекулы через гидрофобную липидную мембрану ЭПР. Образуется проинсулин, который транспортируется в комплекс Гольджи, где происходит частичный протеолиз - из молекулы проинсулина с помощ ью специфических эндопептидаз вырезается С-пептид - фрагмент из 31 аминокислоты, соединяю щ ий А и В -ц еп и. В секреторны х гранулах инсулин, соединяясь с ионами цинка, образует кристал­ лические гексамерные агрегаты. Это белок из 51 аминокислотного остатка, состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных дисульф идны м и м остикам и (р и с.). Таким обр азом в клетках Лангерганса в результате процессинга из препроинсулина обра­ зуется проинсулин и затем инсулин:

где Сп - это сигнальный пептид, необходимый для экспрессии белка, С соединительный пептид, обеспечивающий необходимую ориентацию А и В цепей при замыкании дисульфидных связей, А - цепь, состоящая из 21 аминокислотного остатка, В - цепь из 30 аминокислотных остатков;

Однако инсулин крупного рогатого скота отличается от челове­ одн ой, п о эт о м у возм ож н а вы работка в ор ган и зм е бол ь н ого человека антител против этих пептидов.

В настоящ ее время используются препараты человеческого и нсули на, получ енны е г ен н о -и н ж ен ер н о й т ех н о л о г и ей, при помощ и рекомбинантных штаммов бактерий (E.c o li), дрож ж ей (Saccharom yces cerevisiae) и др.

Вначале была разработана технология синтеза А и В-цепей, сигнального и соединительного пептидов в одной и той же клетке рекомбинантного штамма E.coli (рис.30). Однако при клониро­ вании и эк сп р есси и гена инсулина человека, в прокариотах синтезировался препроинсулин (в бактериальных клетках нет процессинга), а он не обладает биологической активностью. Далее возможно полученный препроинсулин многоэтапно обработать соответствую щ им и ф ерм ентам и и получить инсулин, но это оказался достаточно сложный и дорогостоящий биохимический процесс.

ПРЕПРОИНСУЛИН



Pages:     | 1 |   ...   | 13 | 14 || 16 | 17 |   ...   | 35 |
 


Похожие работы:

«ЛОМИДЗЕ СЕРГО ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА КК–86 на соискание ученой степени доктора ветеринарии представлена ДИССЕРТАЦИЯ Специальность – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология, иммунология, паразитология Руководитель – член-корр.академии с.-х.наук Грузии, профессор Т.К. Курашвили Тбилиси 2011 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ; ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ; 1. Лекарственные растения в прошлом; 2. Использование лекарственных растений в ветеринарии против грибковых и...»

«КУРС ЛЕКЦИЙ ПО ДИСЦИПЛИНЕ ЛЕСНАЯ ФИТОПАТОЛОГИЯ 6.040102 БИОЛОГИЯ (шифр и название направления подготовки) Специализации микология и фитоиммунология (название специализации) Биологического факультета (название факультета) ХАРЬКОВ 2013 ЛЕСНАЯ ФИТОПАТОЛОГИЯ. Курс лекций по учебной дисциплине для студентов по направлению подготовки 6.040102 - биология, 2013. 62 с. Составитель: Усиченко Андрей Сергеевич, к.б.н., старший преподаватель 2 ЛЕКЦИЯ №1. ИСТОРИЯ ЛЕСНОЙ ФИТОПАТОЛОГИИ. ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ. Лесная...»

«© И. В. Юкляевский, 2014 г. Э М И Л С - 007 ВВЕДЕНИЕ XXI век – время, когда впервые всерьез заговорили не только о болезнях, но и о здоровье. Мужское здоровье – комплексная многодисциплинарная проблема, включающая старение и возрастные болезни мужчин, урологические заболевания, психическое здоровье и образ жизни. Однако, здоровье каждого мужчины складывается не только из психического, физического и социального благополучия, но и сексуальная сторона жизни, при этом, должна быть отражена в полной...»

«50 ЛЕТ ИНСТИТУТУ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА РАМН 50 YEARS OF THE RESEARCH INSTITUTE OF HUMAN MORPHOLOGY RAMS Л.В. Кактурский, О.В. Макарова, М.В. Кондашевская L.V. Kaktursky, O.V. Makarova, M.V. Kondashevskaya Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН Москва, ул. Цюрупы, д.3, 117418, +7(499)1208065, morfolhum_patol_cell@mail.ru Research Institute of Human Morphology RAMS Moscow, Tsurupy, 3, 117418, +7(499)1208065, Резюме: Представлены основные вехи истории и достижения сотрудников...»

«Отзывы на первое издание книги Психология национализма. Уважаемый Роман Людвигович! Закончил чтение Вашей книги Психология Национализма. Купил книгу в С.Петербурге, на Невском. Читать начал в поезде. Чувства захлестнули мою душу. Не мог удержаться то от улыбки радости, то от слез. Ком в горле и чувство гордости распирали меня непрерывно. Как измученный духовной жаждой путник, не мог оторваться от страниц. Прервался только с наступлением ночи, но уснуть не мог. Все, о чем думал я, кратко и...»

«Соловьва Анна Юрьевна ИЗУЧЕНИЕ АККУМУЛЯЦИИ СЕЛЕНА И ВЛИЯНИЯ ЕГО НА НАКОПЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ И ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ЭФИРНО-МАСЛИЧНОМ СЫРЬЕ 06.01. 06 – луговодство и лекарственные, эфирно-масличные культуры Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, доцент Е.Л.МАЛАНКИНА Москва – 2014 2 Список сокращений БАВ - биологически активные вещества ЭМ - эфирное масло СФ - спектрофотометр ГФ 11 -...»

«РАБОЧАЯ ПРОГРАММА учебной дисциплины ЕН.Ф.08 Почвоведение Для специальности 020804.65 Геоэкология Специализация 013602 Региональное геоэкологическое проектирование Для очной формы обучения Составитель/разработчик программы: Линдина Л.И., канд. биол. наук Новокузнецк 2013 Сведения о разработке и утверждении рабочей программы дисциплины Рабочая программа дисциплины (ЕН.Ф.08) Почвоведение федерального компонента цикла ЕН составлена в соответствии с Государственным образовательным стандартом...»

«СХЕМА КОМПЛЕКСНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И ОХРАНЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ БАССЕЙНА РЕКИ ВОЛХОВ Книга 1 Общая характеристика речного бассейна 1 ПРОЕКТ Схема комплексного использования и охраны водных объектов Книга 1. Общая характеристика речного бассейна Общая часть Основной задачей разработки СКИОВО, включая НДВ, бассейна реки Волхов является формирование инструментария принятия управленческих решений по достижению устанавливаемых СКИОВО бассейна реки Волхов целевых показателей качества воды водных объектов...»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.