WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 35 |

«'ч ж Ж у. ч № Ж v ^ jjif 'slfe * |j j | ф v j^ vj АЛМАГАМБЕТОВ К.Х. МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ $$ ш® ф ф Ф ф Ф ШФ ш • ' ~§р ^Р 5$ s& Астана - 2009 щ УДК 60 БКК 52.81 ...»

-- [ Страница 12 ] --

Технология применения гелевого биочипа Наиболее универсальны в технологии применения аффинные биочипы, в которых используются в качестве селектирующего элем ента м оноклональны е антитела, чрезвы чайно разной специфичности и потому, обладающие свойством реагировать с самыми различными белками, обладающими антигенностью и специфичностью (патогенные вирусы и бактерии, атипичные клетки, токсины и др.). Принцип работы такого биочипа основан на реакции специфического взаимодействия антиген-антитело, но в микрообъеме, в микромасштабе. Например, гелевый биочип содержит различной специфичности иммобилизованные моно­ клональные антитела, распознающие соответствующие антигены в исследуемом материале. При внесении в ячейки исследуемого материала, содержащего патогенные вирусы, бактерии, атипичные клетки происходит иммунная реакция взаимодействия антигена с комплементарным антителом, образуется комплекс антигенантитело. Далее, чтобы визуализировать этот комплекс на гель наносится флуоресцентная метка, конъюгированная с антивидовыми антителами, которые взаимодействуют с ранее образовав­ шимся комплексом антиген-антитело и остаются на подложке (непрямая реакция им м уноф луоресценции). О пределение результатов реакции проводится на автоматическом анализаторе, так называемом чип-детекторе, управляемом компьютером. При облучении световыми волнами определенной длины, ячейки гидрогеля, где фиксирована флуоресцентная метка начинают светиться. Анализ распределения свечения в ячейках биочипа, который проводит специальная компьютерная программа, дает ответ на вопрос, есть ли в исследуемом материале патогены, атипичные клетки или нет. В лабораторной практике используются биочипы от одной-двух сотен микроячеек, до мощных приборов, имеющих более четырех тысяч микроячеек.

Взаимодействие антиген-антитело осуществляется теми же по природе силами, что и взаимодействие фермента с субстратом:

вандерваальсовыми силами, ионными, гидрофобными и гидро­ фильными взаимодействиями, водородными связями. Определен­ ная сложность применения антител в биочипах состоит в том,

3. БИОСЕНСОРЫ И БИОЧИПЫ

что образовавшийся комплекс антиген-антитело для регистрации нуж но визуализировать. Э то является общ им недостатком аффинных биочипов и требует применения специальных методов, например, использования ф л уоресц ен тны х м еток. Другая сложность состоит в том, что аффинные взаимодействия часто имею т высокие значения константы ассоциации, т.е. слабо обратимы, и их распознающие элементы в биочипе часто являются одноразовыми или требуют специальных методов регенерации.

3.3. ДНК биочипы ДНК биочипы - английское название DNA - microarrays, т.е.

органи зованное разм ещ ение молекул ДН К на специальной подложке или платформе, изготовленной из стекла, полимеров, гелей (полиакриламид) или пластика. Иногда используют и другие материалы, например кремний, также как на электронны х микросхемах. ДНК как биоматериал может быть размещен в ячейках с гидрогелем (гелевые биочипы) либо иммобилизован непосредственно на твердой подложке чипа (поверхностны е биочипы). С целью иммобилизации молекул ДНК на подложке проводится обработка поверхности специальными реактивами — органотриалкоксиланами, глицидилоксисиланами и др. В ходе такой обработки происходит образование силоксановых мостиков между модифицирующим реагентом и поверхностными атомами, в результате чего на поверхности подлож ки ф орм ируется достаточно больш ое количество функциональных групп (как правило, аминогруппы ), используем ы х для имм обилизации олигонуклеотидов либо непосредственно, либо через несколько стадий формирования «нож ки», обеспечи ваю щ ей больш ую конформационную свободу олигонуклеотида. Иммобилизуются (как правило, ковалентно) однонитевы е фрагменты ДНК олигонуклеотиды (короткие - 15-60 нуклеотидов и длинные - 100нуклеотидов) при помощи робота (рис. 19). Соответственно, биочипы делятся на олигонуклеотидные и ДНК-вые поверхностные биочипы. Это организованное размещ ение ДНК занимает на платформе очень небольшой участок, размером от почтовой марки до визитной карточки. М икроскопический размер биочипа позволяет размещать десятки и сотни тысяч разных олигонукД Н К биочипы леотидов, фрагментов ДНК, способных взаимодействовать с комплементарной нитью нуклеиновой кислоты в исследуемом материале.

Изготовленный таким образом ДНК-биочип в дальнейшем гибридизуют с молекулами исследуемой ДНК, мечеными краси­ телем и считывают с ячеек информацию с помощью флуоресцент­ ного микроскопа или специального лазерного устройства для чтения. Днк-биочипы являются наиболее распространенными и чаще на подложке из стекла.

Белковые чипы, на которых проходят ферментативные реакции имеют более редкое расположение ячеек.

Рис. 19. Для приготовления биочипов стали использоваться роботы, применяемые прежде в микроэлектронике для создания микросхем.

На стеклянную подложку в автоматическом режиме наносится биоматериал в ничтожно малых количествах с очень точным местоположением конкретного олигонуклеотида или кДНК. Для иммобилизации биоматериала проводится обработка стекла, с нанесенной на ее поверхность нуклеиновой кислоты ультрафиолетом, стимулирующим образование химических связей между Схема применения Д Н К -биочипа:

1) выделенная из анализируемого материала, гибридизуемая (исследуемая) ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточ­ ных количествах с помощью ПЦР. В усовершенствованных моделях ассиметричная мультипраймерная ПЦР-амплификация

3. БИОСЕНСОРЫ И БИОЧИПЫ

гибридизуемой ДНК осуществляется непосредственно в ячейках биочипа. Кроме этого на чипе можно осуществлять фрагментацию, фосфорилирование, лигирование ДНК. Исследуемая ДНК после амплификации расщепляется на определенные фрагменты фер­ ментами - рестриктазами и проходит предварительную обработку, которая заклю чается в том, что фрагменты конъюгируются с флуоресцентной меткой. Получается набор из огромного числа маркированны х олигонуклеотидов, являю щ ихся составными частями исследуемой ДНК;

2) в гелевые микроячейки биочипа с нанесенными диагности­ ческими известными олигонуклеотидами вносятся микрокапли исследуемой (гибридизуемой) ДНК;

3) гибридизация исследуемых нуклеиновых кислот с нане­ сенными на стекло однонитевыми олигонуклеотидами. Чип поме­ щают на ночь в термостат, где должен произойти процесс гибри­ дизации комплементарны х нитей ДНК. Если в исследуемом образце имеется олигонуклеотид, комплементарный закреплен­ ному в ячейке, то между ними, образуется связь, и при промывании он не будет удален, в отличие от не связавшихся олигонуклео­ тидов;

4) визуализация результатов гибридизации и анализ получен­ ного изображения с использованием анализаторов со специально разработанными компьютерными программами (рис. 20, 21). С этой целью после промывки биочип высушивают и при помощи анали­ затора оценивают наличие и активность флуоресцентного свече­ ния в ячейках. Затем по результатам компьютерного анализа, зная олигонуклеотиды, которые были изначально помещены в данные ячейки, и учитывая однозначность образования комплементарных пар, определяется видо-, типоспецифичность исследуемой ДНК.

П редел об наруж ени я м иним альны х концентраций ДНК в анализируемой пробе может достигать 10 аМ (1 0 1 м). Другой метод оценки результатов анализа с использованием ДНК-микрочипов основан на измерении сил электростатического отталкивания, возникающего между объектами, обладающими зарядами одинакового знака. С этой целью на поверхность микро­ чипа после проведения гибридизации (исследуемый образец ДНК без флуоресцентной метки) наносится жидкость, содержащая мельчайшие электрически заряженные кремниевые (стеклянные) Рис. 20. Анализатор биочипов с портативным Рис.21. Биочип -детекция флюоресцентным микроскопом, разработанный сферы. Затем анализируют броуновское движение этих сфер на S поверхности микрочипа и измеряют силы электрического отталки вания меж ду заряж енн ы м и сф ерам и и м олекулам и Д Н К, i прогибридизовавш имися с иммобилизованными на микрочипе известны ми олигонуклеотидам и. Такие измерения позволяю т | анализировать миллионы последовательностей ДНК одновременно. Эта технология не менее чувствительна, чем флуоресцент­ ное мечение образцов.

О пределять прореагировавш ие зонды такж е можно массспектрометрией (по возрастанию молекулярного веса зондового вещества, об этом свидетельствует изменение электропроводности I анализируемого материала).

Биочип - устройство не одноразового использования, при соот­ ветствующей отмывке его можно применять несколько десятков * раз. Наряду с воспроизводимостью результата биочип характери­ I зуется высокой чувствительностью, быстрым временем отклика, легкостью градуировки, безопасностью и надеж ностью. Для I имплантируемых биочипов одной из важнейших проблем является биосовместимость и стабильность сенсорных биомолекуд и таким I образом, время жизни импланта.

Белковые биочипы куда сложнее в изготовлении и применении;

I белки легко инактивируются; принцип этих чипов основан на им м об и ли зац и и м о н о клональны х антител к тем или иным антигенам (чащ е возбудителям инфекций), также могут быть иммобилизованы гормоны, аллергены и другие белки.

3. БИОСЕНСОРЫ И БИОЧИПЫ

Будущ ее биочипов связано с нанотехнологиям и, позволяю ­ щими создать:

- сложные портативные приборы lab-on-chip;

- имплантируемые биосенсоры;

- недорогие полногеномные матрицы.

Применение биочипов 1) Разработаны биочипы, которые позволяют диагностироват генетически измененные микобактерии туберкулеза, устойчивые к воздействию антибиотика, в частности к рифампицину (рис.22).

Пластинка гелевого биочипа, в ячейках которого содержится в к ач естве зо н д а один из н аи бо л ее х а р а к те р н ы х ф рагм ен тов одинарной спирали ДНК микобактерий туберкулеза, устойчивых расщепляется сайт-специфическими рестриктазами на фрагменты, которые амплифицируются до необходимой концентрации, затем двойные спирали ДНК расщепляются на одинарные, и получив­ шийся раствор наносится на поверхность биочипа. При этом фрагменты одинарных спиралей исследуемой ДНК гибридизуются только с комплементарными им фрагментами олигонуклеотидов, иммобилизованных в геле. Положительный результат детектирует­ ся при помощи флуоресцентной метки или другими способами.

2) ДНК биочип позволяет точно диагносцировать два подтип острого лейкоза (острый миелоидный и острый лимфобластный), что им еет о п р ед ел яю щ ее зн ач ен и е при вы боре прави льн ой терапии. П ревоначально был использован олигонуклеотидный биочип из 6000 генов. Используя в качестве пробы РНК из клеток костного мозга, исследователям удалось выделить и подготовить к реальному использованию в качестве малого чипа набор из генов, сильное различие по экспрессии которых позволяет одно­ значно определить тип опухоли. После гибридизации на биочипе возникаю т причудливы е узоры.

Эти узоры бывают разными у нормальных и у раковых клеток или сильно различаются при различных видах лейкозов. И злечи­ мые виды лейкозов даю т одни узоры (паттерны ), неизлечим ы е дают совсем другие паттерны. Используя биочипы, можно диагносцировать характерны е приж изненны е м утации в генетическом коде. Так в геноме человека есть два гена, которые в здоровых, не мутировавш их клетках расположены достаточно далеко друг от друга. В результате патологических перестроек в Д Н К они могут оказаться по соседству, в частности это является одним из достоверных свидетельств начала лейкоза;



Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 35 |
 


Похожие работы:

«ПРОБЛЕМНО­ОРИЕНТИРОВАННОЕ ОБУЧЕНИЕ НА БАЗЕ  ОТСМ­ТРИЗ  Система проектных работ для начальной школы  Голицына Н.Б., Нестеренко А.А.  Комплексный  проект Листья  Введение  Учитывая    интерес  педагогов  начальной  школы  к  проектной  и  исследовательской  деятельности,  усиленный  в  настоящее  время  переходом  на  новые  образовательные  стандарты,  можно  только  удивиться недостаточному вниманию, которое уделяется в ряде программ проектам, связанным с  объектами  живой  природы. ...»

«Государственный комитет по лесному хозяйству Республики Тыва ЛЕСОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ РЕГЛАМЕНТ ГКУ РТ ТАНДИНСКОЕ ЛЕСНИЧЕСТВО Исполнитель: Общество с ограниченной ответственностью Научно – Проектный Центр Инженерно-Изыскательских Работ Генеральный директор Попов П. И. г. Воронеж, 2011 г. 2 Оглавление Введение.. 6 Глава 1 Общие сведения.. 13 Краткая характеристика.. 1.1 13 Наименование и местоположение лесничества. 1.1.1 13 Общая площадь лесничества и участковых лесничеств. 1.1.2 13 Распределение...»

«Каталог № 3.2004 Обращаем Ваше внимание на то, что Каталог № 3.2004 действителен с 29 сентября 2004 г. (с изменениями на 4 ноября). На все поставляемое оборудование дается гарантия 1 год с даты поставки и обеспечивается послегарантийное техническое обслуживание. Остаточные сроки годности иммуноферментных тест-систем - не менее 6 месяцев при поставке по контракту, не менее 4 месяцев при поставке со склада; при поставке со склада сроки годности остальных реагентов - не менее 4 месяцев,...»

«Государственный комитет по лесному хозяйству Республики Тыва ЛЕСОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ РЕГЛАМЕНТ ГКУ РТ ШАГОНАРСКОЕ ЛЕСНИЧЕСТВО Исполнитель: Общество с ограниченной ответственностью Научно – Проектный Центр Инженерно-Изыскательских Работ Генеральный директор Попов П. И. Воронеж, 2011 г. Оглавление Введение.. 6 Глава 1 Общие сведения.. 13 Краткая характеристика.. 1.1 13 Наименование и местоположение лесничества. 1.1.1 13 Общая площадь лесничества и участковых лесничеств. 1.1.2 13 Распределение...»

«Соловьва Анна Юрьевна ИЗУЧЕНИЕ АККУМУЛЯЦИИ СЕЛЕНА И ВЛИЯНИЯ ЕГО НА НАКОПЛЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ И ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ЭФИРНО-МАСЛИЧНОМ СЫРЬЕ 06.01. 06 – луговодство и лекарственные, эфирно-масличные культуры Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, доцент Е.Л.МАЛАНКИНА Москва – 2014 2 Список сокращений БАВ - биологически активные вещества ЭМ - эфирное масло СФ - спектрофотометр ГФ 11 -...»

«Содержание: Территория заповедника 1. 4 Пробные и учетные площадки, ключевые участки, постоянные (временные), маршруты 4 Рельеф 3. 13 Почвы 4. 13 Погода 5. 12 Воды 6. 12 Флора и растительность 7. 12 Флора и ее изменения 12 Новые виды и новые места обитания ранее неизвестных видов 13 Редкие виды макромицетов на территории заповедника и сопредельных территориях 14 Растительность и ее изменения 14 Флуктуации растительных сообществ 14 7.2.2.6. Плодоношения грибов 14 7.2.3. Лесопатологические...»

«ЛЖЕНАУКА–ГЕНЕТИКА. ЧУМА ХХ ВЕКА. Сигизмунд Сигизмундович Миронин Человек подобен фонтану. Все та же форма – но всегда новая вода (Гераклит) СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АННОТАЦИЯ ВВЕДЕНИЕ КАК РОДИЛАСЬ ЭТА КНИГА? ГЛАВА 1. КТО НАЧАЛ АТАКУ ПЕРВЫМ? 1.1. НАПАДЕНИЕ ФОРМАЛЬНЫХ ГЕНЕТИКОВ НА МИЧУРИНЦЕВ 1.2. РЕШАЮЩИЙ УДАР ФОРМАЛЬНЫХ ГЕНЕТИКОВ – ДОКЛАД Ю.ЖДАНОВА 1.3. КАК ГОТОВИЛАСЬ СЕССИЯ ВАСХНИЛ? 1.4. ГОРЯЧИЙ ИЮЛЬ 1948 ГОДА 1.5. ПОЧЕМУ НЕ СОСТОЯЛИСЬ ВЫБОРЫ В ВАСХНИЛ? 1.6. ДИСПОЗИЦИИ СТОРОН ПЕРЕД РЕШАЮЩЕЙ...»

«РОССИЯ ПОСЛЕ РИО: ТЕНДЕНЦИИ ПОЛЯРИЗОВАННОГО РАЗВИТИЯ А.Ю.Ретеюм Географический факультет, МГУ, Москва, Россия Настоящая задача: сообразовать все социальные учреждения с безусловною нравственно-общественной нормой, в борьбе со злом. В.С.Соловьев Вводные замечания Конференция ООН в Рио-ди-Жанейро служит общей точкой отсчета для экологоэкономических оценок изменений ситуации в разных странах. Признание принципа равноправия нынешнего и будущих поколений людей для обеспечения устойчивого развития...»

«В.В. Никонов1, И.В. Зайцева1, К.Н. Кобяков2, Д.Ю. Смирнов1, Н.В. Лукина1, В.Н. Петров1 КОРЕННЫЕ (СТАРОВОЗРАСТНЫЕ) ЛЕСА МУРМАНСКОЙ ОБЛАСТИ* 1 Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра РАН 2 Кольский филиал Центра охраны дикой природы Дан всесторонний анализ формирования, распространения и функционирования коренных лесов Мурманской области – наиболее северных лесов Европейской России. Обращается внимание на антропогенную угрозу этим уникальным природным объектам,...»

«ОХРАНА ЖИВОТНОГО МИРА В УСЛОВИЯХ ХОЗЯЙСТВЕННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ – организованная деятельность людей, направленная на их жизнеобеспечение (неорганизованные действия и/или не направленные на жизнеобеспечение не могут считаться таковой). Охота и собирательство относятся к хозяйству присваивающего типа. Современное охотничье хозяйство уже не может считаться таковым в полной мере, т.к. включает дичеразведение, биотехнию и т.п. меры управления охот ресурсами (т.е....»






 
© 2013 www.knigi.konflib.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.