«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ 2-Е ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ В 3 томах 3 Перевод с английского канд. биол. наук В. П. Коржа, канд. биол. наук Н.В. Сониной, ...»

Некоторые данные о том, как активированный фитохром вызывает ответ в компетентных клетках, получены на папоротнике Onoclea. Для прорастания спор этого растения необходим красный свет, а дальний красный свет ингибирует прорастание. Вначале, по-видимому, фитохром инициирует кратковременный приток Са2+ из окружающей клетку среды, в результате чего содержание Са2+ в цитозоле увеличивается. Ионофоры Са2+ ускоряют прорастание и в отсутствие света. Остается неясным, какова роль фитохрома в индуцируемых светом реакциях, в результате которых происходят изменения в транскрипции генов. Вероятно, протеинкиназы, чувствительные к притоку ионов Са2+, фосфорилируются, активируя при этом факторы транскрипции, специфичные для фоторегулируемых генов.

Рис. 20-67. Структурные формулы регуляторов роста растений. Для каждой из пяти групп регуляторов роста приведено по одному представителю, встречающемуся в распространенного комнатного растения Coleus (продольный срез стебля, световая микрофотография).

Проводящие сосудистые пучки в области раны были перерезаны. Семь дней спустя в результате стимуляции клеточного деления и передифференцировки близлежащих клеток коры возникло много новых клеток ксилемы и флоэмы и была восстановлена непрерывность проводящих структур в области повреждения. Ауксин обычно поступает к основанию растения из верхушки.

Полагают, что повреждение тканей вызывает новый направленный поток ауксина, который в свою очередь индуцирует регенерацию сосуда, показанную на этой микрофотографии. (С любезного разрешения N. P.

20.5.9. Культура клеток и тканей - модный инструмент для изучения развития растений [36] При определенных условиях зрелые растительные клетки сохраняют способность делиться, а в некоторых случаях могут даже вступить на новый путь развития. Такая пластичность дает растению возможность восстанавливаться после повреждения. Например, если надрезать стебель, близлежащие клетки начинают делиться и закрывают рану, при этом другие клетки подвергаются передифференцировке, образуя ксилему и восстанавливая непрерывность проводящей ткани вокруг раны (рис. 20-68).

Такая пластичность свойственна не только целому растению: если культивировать растительную ткань в среде, содержащей необходимые питательные вещества и регуляторы роста, многие клетки начинают делиться. Они способны к неограниченной пролиферации и в конце концов образуют массу относительно недифференцированных клеток, называемую каллусом. Если правильно подобрать питательные вещества и регуляторы роста, то внутри каллуса начинают формироваться побеги, а затем корень; у многих видов таким образом удается регенерировать целиком новое растение (рис. 20-69).

Каллус можно механически разделить на отдельные клетки и выращивать их затем в суспензионной культуре. В такой культуре клетки очень похожи друг на друга: все они имеют тонкую первичную клеточную стенку и крупные вакуоли, пересеченные тонкими тяжами цитоплазмы (рис. 20-70). В ряде случаев из одиночных клеток, выделенных из суспензии, удавалось вырастить целое взрослое растение. Удачные Рис. 20-69. Выращивание целого растения из клеток каллуса. В культуре каллуса Freesia (А) индуцировали сначала развитие побегов (Б), а затем корней (В), меняя соотношение ауксинов и цитокининов в среде. Для формирования побегов и листьев цитокинина в среде должно быть больше, Рис. 20-70. Культуры каллуса можно поддерживать в жидкой среде в виде суспензии одиночных клеток. На микрофотографии показаны две такие клетки из каллуса платана. Они сильно вакуолизированы, и от ядра отходят цитоплазматические тяжи. У этих клеток есть первичная клеточная результаты были получены с клетками картофеля, табака, петунии и моркови (рис. 20-69). Такая способность единственной соматической клетки давать начало целому растению хорошо иллюстрирует тотипотентность многих растительных клеток.

Растения, выращенные из культивируемых клеток, характеризуются генетической нестабильностью (сомаклональная вариация). То же явление имеет место, если интактное растение подвергается стрессу. По-видимому, при стрессах, к которым относят и условия культивирования, в клетках растений происходят разнообразные хромосомные перестройки (см. разд. 10.5.10). Образовавшиеся мутантные растения могут иметь преимущества в изменившихся или неблагоприятных условиях. В настоящее время сомаклональные варианты используются селекционерами как исходный материал для получения улучшенных сортов сельскохозяйственных растений.

20.5.10. Использование методов молекулярной генетики для решения проблем развития растений Способность соматических клеток растений и регенерации в культуре дает возможность проводить с такими клетками разнообразные генетические манипуляции и получать трансгенные растения. Для того чтобы облегчить попадание чужеродной ДНК в растительные клетки, их лишают жесткой оболочки. Этого можно добиться с помощью обработки клеток ферментами, гидролизующими связи в полисахаридах клеточной стенки. В результате такой обработки клетки превращаются в протопласты (рис. 20-71). После введения в них чужеродной ДНК протопласты можно заставить вновь сформировать клеточную стенку, индуцировать деление и даже регенерировать новое растение.

Для введения чужеродной ДНК в интактные клетки растений используется вектор, полученный на основе Т-ДНК Agrobacterium, о которой говорилось выше (см. разд. 20.3.3). Для этого гены, ответственные за образование опухоли на растении, удаляются и замещаются желаемыми. После переноса модифицированной Т-ДНК в соответствующую Ti-плазмиду Agrobacterium бактерии культивируют вместе с кусочками листа. Эта система позволяет Т-ДНК встроиться к хромосому растения, в результате чего новый ген стабильно включается в растительный геном (рис. 20-72). К сожалению, этот метод успешно используется лишь для некоторых семейств двудольных растений 1) В последнее время круг трансформируемых видов растений значительно расширился, методика стала применима и к некоторым однодольным растениям, например кукурузе и рису. - Прим. перев.

Рис. 20-71. Световая микрофотография протопластов, полученных из зеленых клеток листьев табака. Клетки, лишенные стенки, округляются: их можно сохранить только в изотоническом растворе. В каждом протопласте видны многочисленные хлоропласты. (С любезного разрешения F.

Рис. 20-72. Схема получения трансгенного растения. Интересующий нас ген кодирует бактериальный белок, токсичный для насекомых. Чтобы ген экспрессировался в растительной клетке, его 5'-конец соединяют с растительным промотором, а З'-конец с сайтом полиаденилирования.

Модифицированный ген токсина встраивают в плазмиду, содержащую кроме него и маркерный ген (например, ген устойчивости к канамицину), по которому можно проводить селекцию. Плазмида сконструирована таким образом, чтобы и ген токсина, и маркерный ген были окружены особыми повторами, размером 25 нуклеотидных пар, которые в норме окружают Т-ДНК. Плазмиду из клеток Е. coli переносят в Agrobacterium, где на отдельной плазмиде присутствуют гены вирулентности. Если такую Agrobacterium культивировать вместе с листовыми дисками, продукты генов вирулентности узнают повторы в Т-ДНК и перенесут ДНК, содержащую маркер и гены токсина в хромосому растения. Все клетки листового диска затем заставляют делиться, помещая экспланты на соответствующую питательную среду, однако способность делиться и образовывать каллус сохранят лишь те клетки, которые содержат ген селективного маркера. Из каллуса затем получают трансгенные растения, которые экспрессируют бактериальный ген инсектотоксина и, следовательно, обладают необычной устойчивостью к насекомым.

Применение методов генной инженерии к клеткам растений способствовало решению многих задач: удалось выделить в чистом виде регуляторы роста, прояснить пути морфогенеза и механизмы экспрессии генов. Более того, открылись новые горизонты в сельском хозяйстве:

появилась теоретическая возможность получать растения с заданными свойствами, например устойчивые к вредителям или способные расти в экстремальных условиях (засоленная или переувлажненная почва).

Хорошо известно, что успехи в изучении механизмов развития у животных были достигнуты благодаря использованию в качестве объекта беспозвоночных, с которыми удобно проводить генетический анализ и эксперименты. Долгие годы модельными организмами служили плодовая мушка Drosophila (см. разд. 16.5) и нематода Caenorhabditis (см. разд. 16.3). Биология развития растений развивается гораздо медленнее.

Это связано с длительностью жизненного цикла у растений и величиной их генома. В последние годы все более широкое применение в качестве объекта молекулярно-генетических исследований находит маленькое травянистое растение Arabidopsis thaliana. Во-первых, оно настолько мало (рис. 20-73), что его можно выращивать в пробирках в лабораторных условиях. Во-вторых, время генерации этого растения составляет всего недель и, наконец, Arabidopsis обладает самым маленьким геномом из всех геномов растений (7 х 107 нуклеотидных пар), растяжением в определенном направлении частично осуществляется микротрубочками, связанными с Рис. 20-73. Arabidopsis thaliana - Raven P. H., Evert R. F., Eichhorn S. E. Biology of Plants, 4th ed., New York, Worth, 1986.

небольшое травянистое растение из Roberts K., Johnson A. W.B., Lloyd C. W., Shaw P.J., Woolhouse H. W., eds. The Cell Surface in Plant Growth семейства крестоцветных, не and Development. J. Cell. Sci., Suppl. 2. Cambridge, U. K., Company of Biologists Ltd, 1985.

имеющее никакой хозяйственной Salisbury F.B., Ross C. W. Plant Physiology, 3rd ed. Belmont, CA, Wadsworth, 1985.

ценности, однако необычайно генетических экспериментов с 1. Bacic A., Harris P.J., Stone B.A. Structure and Function of Plant Cell Walls. In Biochemistry of Plants: A растительными объектами. Comprehensive Treatise (J. Preiss, ed.), Vol. 14, Carbohydrates, pp. 287-371. San Diego, CA, Academic Press, Небольшой геном Arabidopsis (7 х 1988.

10 нуклеотидных пар) сопоставим по размеру с геномом дрозофилы (10 х 107 нуклеотидных пар). (С любезного разрешения Ch.

Brett С. Т., Hillman J. R., eds. Biochemistry of Plant Cell Walls. SEB Seminar Series, 28. New York, Cambridge University Press, 1985.

McNeil M., Darvill A. G., Fry S. C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu Rev. Biochem., 53, 625 663, 1984. Rees D.A. Polysaccharide Shapes. London, Chapman and Hall, 1977.

2. Cassab G. /., Varner J. E. Cell wall proteins. Annu. Rev. Plant Physiol., 39, 321 -353, 1988. Fry S. Cross-linking of matrix polymers in the growing cell walls of angiosperms. Annu. Rev. Plant Physiol., 37, 165-186, 1986.

Selvendran R. R. Developments in the chemistry and biochemistry of pectic and hemicellulosic polymers. J. Cell Sci. Suppl., 2, 51-88, 1985.

3. Carpita N.. Sabularse D., Montezinos D., Delmer D. P. Determination of the pore size of cell walls of living plant cells. Science, 205, 1144 1147, 1979.

Milburn J. A. Water Flow in Planls. London, Longman, 1979.

4. Street H. E., pik H. The physiology of Flowering Plants, 3rd ed. London, U. K., Edward Arnold, 1984.

5. Fry S. C. The Growing Plant Cell Wall: Chemical and Metabolic Analysis. New York, Wiley, 1988.

Masuda Y., Yamamoto R. Cell-wall changes during auxin-induced cell extension. Mechanical properties and constituent polysaccharides of the cell wall. In Biochemistry of Plant Cell Walls; (C.T. Brett, J. R. Hillman, eds.), pp. 269 300. SEB Seminar Series 28, New York, Cambridge University Press, 1985.

6. Baker D. A., Hall J. L. Ion Transport in Plant Cells and Tissues. Amsterdam, North-Holland, 1975. Cheeseman J. M. Mechanisms of salinity tolerance in plants. Plant Physiol., 87, 547 550, 1988.